Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором 33

"."-.Ф "5 6ою 11,.таи .Р Т ТВ метода одного ныи способ облах недостатков, а чистки вными он-парКи) количеств продукт сово ТЭАБ, т.е. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ И К АВТОРСКОМУ СВИД(71) Хозрасчетное опытное предприятиеиРадиопрепарати Института ядерной физики АН УЗССР(56) 1, Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии, Под ред. А.Хеншени др., М,; Мир, 1988, с, 451 - 488. Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано для получениянуклеотидов, меченных фосфороми фосфором. Указанные соединения широкоиспользуются в молекулярной биологии, биохимии и т.д; для исследования первичнойструктуры нуклеиновых кислот, а также дляисследования структуры и функций различ.:ных ферментов,Известен способ очистки нуклеотидов,меченных радиоактивным фосфором, с использованием ВЭЖХ на колонках, запол. ненных аминопропилсиликагелем (АПС), вградиенте водного триэтиламмонийбикарбоната (ТЭАБ). Этот способ позволяет получать меченые нуклеотиды высокогокачества.В.то же время, указандает рядом существенныименно:при очистке малых (5-10 ммеченых нуклеотидов целевойдержит значительное количест 2(57) Использование: молекулярная биология, биотехнология, очистка нуклеотидов. Сущность: использование ион-парной хроматографии на колонках, заполненных октадецилсиликагелем объемом 1,5 - 2 мл; элюирование линейным градиентом вода - этанол от 0 до 100 за 25 мин, в качестве ион-парного реагента используют триэтиламмонийбикарбонат в конечной концентрации 0,04 - 0,06 М, 4 ил., 3 табл. не может быть использовано без предварительного упаривания,колонки с АПС обладают малым сроком службы и при разовой загрузке 50-100 мКи подлежат замене йосле 10 хроматографий, что приводит к повышению себестоимости готового продукта и к дополнительному облучению персонала;ъ.для получения продукта с низким содер- СО аханием ТЭАБ приходится испояьаоаать ко- ( Оь лонки малого размера, что неудобно при .С) работе в перчаточном боксе; Ыдля получения меченых нуклеотидов с р высокой объемной активностью (20 - 50 мКИ/мл) в водном растворе приходится упаривать готовый продукт для удаления ТЭАБ, что отрицательно сказывается на его качест- ф Цель изобретения - создани чистки меченых нуклеотидов, св т перечисленных недостатков.ную хроматографию на колонках с ОДС влинейном градиенте этанола, а в качествеион-парного реагента используют ТЭАБ.С целью оптимизации условий разделения при разработке метода были опробоеаны хроматографические колонкиразличного размера,При этом выяснилось,что использование колонок малого размеранецелесообразно, так как в этом случае продукт выходит с колонки в малом объеме 10(0,03-0,05 мл) и его трудно собрать, Крометого, с такими колонками неудобно работать в перчаточном боксе. В то же времяиспользование колонок размером 4 х 150 мм(объем 1,8 мл) позволяет получить продукт в 15объеме 0,2-0,5 мл. Экспериментально обнарукено, что использование колонок объемами 1,5-2 мл наиболее рационально длядостижения цели,Дальнейшее увеличение размеров колонки приводит к увеличению обьема выхо.да, что нежелательно, поэтому для массовойочистки меченых нуклеотидов были выбраны колонки с размером 4 х 150 мм. Былоэкспериментально установлено, что колонка такого размера выдеркивает 200 - 250хроматографий при разовой загрузке 50 -100 мКи; т.е. в 20-25 раз больше, чем указано в работе 1, Как было установленоэкспериментально, ТЭАБ обеспечивает хорошее удерживание нуклеотидов на колонках с ОДС в концентрациях 0,04 - 0,06 М,Столь низкая концентрация соли позволяетизбежать разложения соли на колонке и дает возможность получить готовый продукт с 35высокой обьемной активностью без обессоливания, Снижение концентрации ТЭАБ до0,025 - 0,03 М существенно снижает времяудерживания нуклеотидов и ухудшает воспроизводимость результатов. Увеличение 40концентрации ТЭАБ до 0,08-0,15 М не даетсущественного выигрыша и приводит к дополнительному солевому загрязнению продукта (табл, 1),Определение концентрации ТЭАБ в готовом продукте показало, что даже в случаеполучения последнего в количестве 1-2 мКиона не превышает 0.03 М, такой продукт былпригоден для дальнейшей работы без предварительного упаривания. 50Примеры конкретного исполнения.П р и м е р 1. Выделение дезоксиаденозин- сР Ртрифосфата,К реакционной смеси объемом 0,5 мл,содержащей 90 мКи (18 нмоль) а -з 2 РдАТФ, 5510 мКи (2 нмоль)а РдАМФ, 3 нмольАДФ, 50 нмоль АТФ, 0,1 мг белка, 2 мкмольМЯС 12, 1 мкмоль КС 1, 5 мкмоль Тгз-НС 1, добавляли 0,013 мл 1 М раствора ТЭАБ, затем наносили на колонку ЯИазогЬ Св размером4 х 150 мм, предварительно уравновешенную 0,05 М ТЭАБ, Элюцию проводили градиентом концентрации этанола от 0 до 100 за 25 мин со скоростью потока 0,5 мл/мин,Время удерживания дАТФ составляло 19,07мин, объем фракции, содержащей продукт0,2 мл, концентрация ТЭАБ в готовом продукте 0,00025 М,На фиг, 1 приведен профиль элюции йРдАТФ, циЯами отмечены: 1 - АДФ; 2 -АТФ; 3 -а- РдАМФ; 4 - а - РдАТФ,Аналогичное выделение 100 мКиаРдАТФ позволило получить готовый продукт с объемной активностью 10 - 50 м Ки/млв водном растворе с концентрацией ТЭАБ0,002-0,02 М без дополнительного обессоливания.П р и м е р 2. Выделение гуанозин- а -Рмонофосфата,К реакционной смеси объемом 0,20 мл,содержащей 80 мКи (16 нмоль) а - РГМФ,20 мКи (4 нмоль)у - РАТФ, 100 нмоль Р-КАР, 40 нмоль АДФ, 5 мкмоль Тг 1 з-НС 1, 1мкмоль КС 1, 2 мкмоль М 9 С 12 и 0,1 мг белка,добавляли 0,01 мл 1 М раствора ТЭАБ. затемнаносили на колонку ЯИазогЬ С 1 в размером4 х 150 мм, предварительно уравновешенную 0,05 М водным ТЭАБ. Монофосфат элюировали градиентом концентрации этанолаот 0 до 10% за 25 мин, скорость потока 0,5мл/мин. Время удерживания а - РГМФсоставляло 12,19 мин, объем фракции содержащей ГМФ 0,3 мл,На фиг, 2 приведен профиль элюции аРГМФ, цифрой 1 отмечена РГМФ,Выделенный таким образом продукт далее подвергался ферментативному фосфорилированию до соответствующеготрифосфата с выходом 95-100% без какойлибо дополнительной обработки.П р и м е р 3. Выделение аденозин,у - Ртрифосфата,К реакционной смеси объемом 0,15 мл,содеркащей 85 мКи (16 нмоль)у- РАТФ,40 нмоль АДФ, 100 нмоль /3-КАР, 5 мкмольТг 1 в-НС 1, 1 мкмоль КС 1, 2 мкмоль М 9 С 12 и 0,2мг белка, добавляли 0,01 мл 1 М раствораТЭАБ, затем наносили на колонку ЯИазогЬС 1 в размером 4 х 150 мл, предварительноуравновешенную 0,05 М водным ТЭАБ. Трифосфат элюировали градиентом концентрации этанола от 0 до 10% за 25 мин, скоростьпотока 0,5 мл/мин.Время удерживания у-АТФ составляло17,74 мин, объем фракции, содеркащей уАТФ 0,2 мл, концентрация ТЭАБ в готовомпродукте 0,00035 М.1786034 Таблица 1 Зависимость времени удерживания, химической чистоты нуклеотида и концентрации ТЭАБв готовом продукте от концентрации ТЭАБ в элюирующем растворе для дезоксиаденозин 5 - а - Ртрифосфата ( см. пример 1 ) Концентрация ТЭАБ в готовом продукте,мольл0,0001 0,00012 0,000180,00025 0,00034 0,00048 . 0,000790,0012 0,0020 0,0027 0,0034 На фиг. 3 приведен профиль элюции уРАТФ, цифрами отмечены; 1 - АДФ; 2 -згу-РАТФ.П р и м е р 4, Выделение уридин,-а-зг Ртрифосфата,К реакционной смеси объемом 0,5 мл,содержащей 70 мКи(14 нмоль) а- РУТФ,10 мКи а- РУМФ, 50 нмоль АТФ, 0,1 мгбелка, 2 мкмоль М 9 Сг, 5 мкмольТгэ-НС,добавляли 0,025 мл 1 М раствора ТЭАБ,затем наносили на колонку Я аэогЬ С 1 в размером 4 х 150 мм, предварительно уравновешенную 0,05 М ТЭАБ.Элюцию проводили градиентом концентрации этанола от 0 до 10 за 25 мин соскоростью потока 0,5 мл/мин, Время удерживания а - РУТФ составляло 14,57 мин,объем фракции, содержащей продукт, 0,3мл, концентрация ТЭАБ в готовом продукте0,0004 М.На фиг. 4 приведен профиль элюции а-згРУТФ, цифрами отмечены; 1 -аР 1 УМФ, 2 -аРУТФ; 3 - АТФ,Время удерживания для других нуклеозид-моно- и трифосфатов, меченных фосфороми фосфором - 33, приведено втабл, 2,( Р)-нуклеотиды не отличались от сооветствующих ( Р)-нуклеотидов по своим,и т.д,).Химическая чистота и концентрацияТЭАБ в готовых препаратах приведены втабл. 3. Радиохимическая чистота всех выделенных продуктов составляла 97-99 даже при выделении смеси, содержащей 150 иболее мКи меченого соединения,Таким образом, совокупность известных признаков с предложенными сущест 5 венными отличиями, а именноиспользование ион-парной высокоэффективной хроматографии на колонках определенных размеров с определеннымнаполнителем, а также экспериментально10 подобранных условий и режимов проведения элюирования обеспечили достижениецели - высокую химическую чистоту; снижение облучения персонала за счет болееудобных условий работы в боксе и значи 15 тельного увеличения срока службы колонок,Формула изобретения Способ очистки нуклеотидов, меченныхфосфороми фосфором, путем пропу скания реакционной смеси через высокоэффективную колонку с производным силикагеля г последующим элюированием нуклеотидов, с использованием триэтиламмоний карбоната, о т л и ч а ю щ и й с я тем, 25 что, с целью повышения химической чистоты целевого продукта, увеличения срока службы колонок и повышения безопасности процесса., используют ион-парную высокоэффективную жидкостную хроматографию 30 на колонках, заполненных октадецилсиликагелем, объемом 1,5 - 2 мл, а элюирование проводят линейным градиентом вода - этанол от Одо 10% за 25 мин, причем в качестве ион-парного реагента используют триэтиламмонийбикарбонат в конечной концентрации 0,04-0,06 М.1786034 Продолжение таблицы 1 Таблица 2 Время удерживания различных нуклеотидов. Разброс во времени удерживания в различных опытах составлял более 5%. римеча П р и м е ч а н и е, Химическую чистоту выделенного продукта определяли хроматографически по методике, приведенной в работе 1, с. 464. Концентрацию ТЭАБ определяли кондуктометрическим методом по калибровочным кривым,1786034 Таблица 3 Сравнение качества препаратов, выделенных методами ионообменной и ион-парной хроматографииИон-парная хроматография Нуклеотид Химическая чистота, Химическая чистота, Концентрация ТЭАБ, моль/л Концентрация ТЭАБ,моль/л П р и м е ч а н и е. Ион-парную хроматографию проводили, как в примерах 1-4 . Активность нуклеотида составляла 50 мКи. Химическую чистоту выделенного продукта определяли хроматографически по методике, приведенной в работе 1, с,464,Концентрацию ТЭАБ определяли кондуктометрическим методом по калибровочным кривым. 20,0 5-АМФ 5-УМ Ф 5-ГМФ 5-ЦМФ 5-дАМФ 5-ТМ Ф 5-дГМФ 5-дЦМ Ф 5-АТФ 5-УТФ 5-ГТФ 5-ЦТФ 5-дАТФ 5-ТТФ 5-дГТФ 5- ТФ 91 90 90 90 92 9490 90 93 91 91 94 95 94, 90 95 0,008 0,007 0,007 0,009 0,01 0,006 0,004 0,004 0,01 0,01 0,015 0,015 0,015 0,015 0,015 0,015 97 96 97 96 99 97 99 96 99 98 98 96 99 98 99 97 0,0025 0,004 0,001 0,003 0,0006 0,002 0,00065 0,003 0,00035 0,0004 0,0003 0,0009 0,00025 0,0003 0,00025 0,00085ставитель Л,Панфилоред М,Мо гентал Тираж Подписноеосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5