Способ получения каллуса кукурузы

(19) 111) 1)5 А 01 Н 4/ 2 ч 5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР СПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ЬСТВ АВТОРСКОМ 8рной биологии юл, %4 одекуля Айтхож М.К.Ка 088,8) С,. ет ХгаЫе еаепт В 2, р. абае(21) 4771942/13 (22) 20.12.89 (46) 30.12,91. Б (71) Институт м химии им. М.А. (72) Л.Р.Сайб и (53) 578,085.23 (56) Агаэтгопд ааптепапсе о 1 аае апб аооч 1985, 6, ч. 64,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЛУСА КУКУРУЗЫ Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм кукурузы, обладающих хозяйственно ценными признаками.Целью изобретения является повышение выхода эмбриогенного каллуса,Способ состоит в том, что эксплантаты культивируют при повышенной температуре(29 - 32 С) на питательной среде Мурасиге и Скуга, в которую совместно добавляют три ауксина в определенных концентрациях; Дикамбу, Пиклорам и 2,4-Д (по 0,1-0,5 мг/л). При совместном их внесении эмбриогенные каллусы образуются со значительно большей частотой, чем когда ауксины добавляются по отдельности,(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры тканей и клеток, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности гибридов и исходных форм кукурузы, обладающих хозяйственно ценными признаками, Целью изобретения является повышение выхода эмбриогенного каллуса, Способ состоит в том, что незрелые зародыши кукурузы культивируют на питательной среде МурасигеСкуга при температуре 29 - 32 С, при этом в среду дополнительно вносят Дикамбу, Пиклррам и 2,4-Д. 6 табл. соб осуществляегся следующим обВ качестве зксплантатов используют незрелые зародыши кукурузы сорта Шиндельмайзер, линий ИК 226-ТВ, А 554, размером 1,5-2,5 мм(15-20 дней после опыления). Незрелые семена поверхностно стерилизуют в 0,1-ном растворе сулемы, после промыви из них вычленяют незрелые зародыши и высаживают щитком вверх на среду с минеральными солями по Мурасиге и Скугу (в основном варианте) с 30 г/л сахарозы, 1 мг/л тиамина, 1 мг/л пиродоксина, 1 мг/л никотиновой кислоть, 100 мг/л мезоинозита, 500 мг/л пролина, 100 мг/л гидролизата казеина.0,8 агара, 0,1 - 0,5 мг/л 2,4-Д, 0,1 - 0,5 мг/л Пиклорама, 0,1-0,5 мг/л Дикамбы, рН среды доводят до 5,8. Культивируют в темноте при 29 - 32 С в течение трех недель. Затем сформировавшиеся каллусы пассиру 1701197ют на свежую питательную среду каждые 2-3 недели. Для регенерации растений сформировавшиеся змбриогенные каллусы переносят на среду с 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л Дикамбы, 0,1 мг/л Пиклорама, 50 мг/л триптофана, 5 мг/л аденина и культивируют на свету при 26 .1 С при 16-часовом фотопериоде,П р и м е р 1. Влияние температуры культивирования на выход эмбриогенного каллуса.Изучают влияние температуры культивирования незрелых зародышей на выход змбриогенного каллуса кукурузы (линия В), Для этого незрелые зародыши высаживают на среду МС с 1 мг/л 2,4-Д и культивируют: а) при температуре 26 1 С; б) при температуре 29 +1 о С в) при 32 .+ 1 С; г) при 35 й 1 ОС.Через 3 недели определяют выход эмбриогенного каллуса, Культивирование при температуре 32 +1 ОС увеличивает выход эмбриогенного каллуса в несколько раз (табл.1).Все далее описываемые опыты проводят при температуре 32 2 Л С.П р и м е р 2. Влияние минеральных солей на выход змбриогенного каллуса кукурузы.Для культивирования тканей кукурузы используют самце разнообразные среды, В связи с этим требуется выяснить, какая из наиболее часто употребляемых сред является наилучшей для образования эмбриогенных каллусов кукурузы из незрелых зародышей. Изучают влияние солей по Мурасиге и Скугу(МС), Гамборга (85), Чу-Вонга (М 6) и Нича на частоту образования эмбриогенных каллусов из различных генотипов. Результаты отражены в табл. 2,Эмбриогенные каллусы образуются с самой высокой частотой на среде Мурасиге и Скуга для всех генотипов. В связи с этим все дальнейшие опыты проводят на среде Мурасиге и Скуга.П р и м е р 3. Влияние фитогормонов на выход эмбриогенного каллуса. Далее исследуют влияние различных ауксинов (2,4-Д, Пиклорама, Дикамбы) и их комбинаций на образование эмбриогенного каллуса, Для этого готовят среду Мурасиге и Скуга в четырех вариантах; с 1 мл/л Пиклорама (среда П), с 1 мг/л 2,4-Д (среда Д), с 1 мг/л Дикамбы (среда Ди), и в четвертую среду вносят по 0,33 мг/л каждого фитогормона (среда ПДДи), Частота образования эмбриогенного каллуса является наиболее высокой на среде ПДДи для всех генотипов (табл. 3).На других средах частота образованияэмбриогенного каллуса различная для раз ных генотипов, причем характер действияфитогормонов различается для каждого генотипа. Так, для сорта Шиндельмайзер среды по способности образовывать змбриогенный каллус можно расположить в 10 ряд; ПДДи ДП - Ди, для линии А 554:ПДДи Ди П Д,адлялинии В 73:ПДДи П Ди = Д. Таким образом, обнаружен факт стимуляции образования эмбриогенного каллуса при совместном внесении в 15 среду культивирования трех фитогормонов:Пиклорама, 2,4-Д и Дикамбы.П р и м е р 4. Подбор оптимальной концентрации фитогормонов для образования эмбриогенного каллуса кукурузы.Далее требуется выяснить, какая кон центрация фитогормонов является оптимальной для каллусообразования, Для этого в среду МС вносят Пиклорам, 2,4-Д, Дикамбу в следующих концентрациях: по 0,1 мг/л каждого фитогормона (среда 0,1 ПДДи), по 25 0,3 мг/л каждого фитогормона (среда 0,3ПДДи), по 0,5 мг/л каждого ауксина (среда 0,5 ПДДи), по 1 мг/л (1 ПДДи) и по 2 мг/л каждого фитогормона (среда 2 ПДДи). В качестве контроля используют среду МС с 1 ЗО мг/л 2,4-Д (среда Д), Частота образованияэмбриогенных каллусов является максимальной(генотип -линия А 554) на среде 0,3 ПДДи, на средах 0,1 ПДДи и 0,5 ПДДи превышает контроль, а на средах 1 ПДДи и 2 35 ПДДи ниже, чем в контроле (табл. 4).Таким образом, оптимум наблюдаетсяпри добавлении О,З мг/л каждого фитогормона. Граничными концентрациями предлагаемого способа будут концентрации 40 каждого фитогормона в 0,1 - 0,5 мг/л, поскольку при этих концентрациях выход эмбриогенного каллуса выше, чем в контроле.П р и м е р 5, Регенерация растений изэмбриогенных каллусов кукурузы.45 Для регенерации растений эмбриогенные каллусы кукурузы переносят на среду МС с 0,1 мг/л Пиклорама, 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л Дикамбы, 50 мг/л триптофана, 5 мл/л аденина и далее их культивируют на свету 50 при 26. +1 С при 16-часовом фотопериоде.Через две недели наблюдают регенерацию побегов. Определяют процент каллусов с регенерацией и количество побегов на каллус (табл. 5).55 Таким образом, из эмбриогенных каллусов, полученных предлагаемым способом, возможна регенерация растений с высокой частотой.1701197 Таблица 1 Влияние температуры культивирования на выход эмбриогенного каллуса Таблиц Влияние минеральных солей на процент формирования эмбриогенного каллуса из незрелых зародышей для разных генотиповТаблица лияние фитогормонов на процент образовани каллуса из незрелых зародышей для разны мбриогенногогенотипов Приведенные данные показывают, что использование способа позволяет увеличить выход эмбриогенного каллуса до 90 (34 в прототипе), причем эффект увеличения выхода наблюдается у различных генотипов. 5Перечень компонентов среды, использовавшихся в осуществлении предлагаемого способа.Состав питательной среды, мг/л:ЙН 4 ЙОз 1650 10 КИОз 1900 СаСг 2 НгО 440 М 9304 7 НгО 370 КНгР 04 170 МагЕРТА 2 НгО 37 3 15 Ре 804 7 НгО 27,8 НзВОз 6,2 Мп 304 4 НгО 22,3 Еп 804 7 НгО 86 КЗ 0,83 20 МагМо 04 2 НгО 0,26 Сц 304 5 НгО 0,0251 СоОг 6 НгО 0,025 Сахароза 30000 Пролин 500 Мезоинозит 100,0 Никотиновая кислота 0,5 Пиридоксин НС 1,0 Тиамин НС 1,0 Агар 7000 рН 5,8 Гормоны (табл, 6) формула изобретения Способ получения каллуса кукурузы,включающий эксплантацию незрелых зародышеФ на модифицированную питательнуюсреду Мурасиге-Скуга и последующее культивирование, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения выхода эмбриогенногокаллуса, зародыши эксплантируют на питательную среду, дополнительно содержащую0,1-0,5 мг/л натриевой соли дихлорфенилуксусной кислоты, 0,1-0,5 мг/л Пиклорамаи 0,1-0,5 мг/л Дикамбы, и культивированиепроводят при 29-32 ОС,Таблица 4 Влияние концентраций фитогормонов на выход эмбриогенного каллуса кукурузы линии А 5545 Табл еганерация растений из полуяенного по данному способу эмбриогенного каллуса существления способ Составитель В.Демкинактор Л.Павлова Техред М,Моргентал Корректор Л.Патай аказ 4485 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГК 113035 Москва, Ж. Раушская наб 4/5 производственно-издательский комбинат ",Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10