Способ определения амилазной активности рубца жвачных животных

(5)5 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКО ВИДЕТЕЛЬСТВУ 2(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ РУБЦА ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам определения амилазной активности в рубце жвачных животных. Цель изобретения - ускорение, упрощение и удешевление способа, Для определения амилазной активности в рубцовую жидкость вносят подкрахмальную индикаторно-субстратную микропленку, содержащую крахмал, желатин, йод кристаллический и йодистый калий при массовом соотношении компонентов: 0,0004:0,0004:0,0033:0,0066 на 0,04 мл дистиллированной воды. Инкубацию осуществляют до полного обесцвечивания микропленки и оценивают количество крахмала, расщепленного в единицу времени. 3 табл. тывают количество крахмала, расщепленного в единицу времени. Желатин выполняет функцию твердофазного носителя крахмала и раствора Люголя (йода кристаллического и йодистого калия),Внесение в рубцовуюкрахмальной индикаторносубропленки исключает мноисполнения анализа, полноекрахмала (обесцвечиваниепроисходит в течение 5 - 30 минв 5-10 раз ускоряет исследовПрименение йодкрахмальнойсубстратной микропленки посить экономичность провотак как расходуется ме(табл. 2),Способ иллюстрируется примерам диньш ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Кишиневский государственный медицинский институт и Институт зоологии и физиологии АН МССР(56) Никитин В.М. Справочник биохимической экспресс-индикации микробов. Кишинев. Картя молдовеняскэ, 1986, с. 91-94.Долгов И.А, Выделение и индентификация амилолитических бактерий рубца жвачных, В кн.: Новые методы и модификации биохимических и физиологических исследований в животноводстве. Боровск, 1972, с.85-88. Изобретение относится к микробиологии и предназначено для ускорения определения амилазной активности микроорганизмов в рубце жвачных животных.Цель изобретения - упрощение, ускорение и удешевление способа.Изобретение осуществляется следующим образом.В отфильтрованную рубцовую жидкость вносят йодкрахмальную индикаторно-субстратную микропленку. которая содержит крахмал, желатин, йод кристаллический и йодистый калий в соотношении, мас,=,ь: 0,0004:0,0004:0,0033:0,0066 на 0,04 мл дистиллированной воды, Микропленку инкубируют в рубцовой жидкости до полного обесцвечивания и расщепления йодкрахмального комплекса черного цвета и рассчижидкость иодстратной микГоэтдпность расщепление микропленки) инкубации, что ания (табл, 1), индикаторнозволяет повымых анализов, е реактивов5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 П р и м е р 1. Для приготовления микропленки в пробирку 1 вносят растворимого крахмала 0,1 г, приливают 7,9 мл дистиллированной воды, взбалтывают и нагревают над горелкой, доводя до кипения, и получают прозрачный раствор крахмала (субстрата). В пробирку 2 берут 1,0 г пищевого желатина и заливают 9,0 мл холодной дистиллированной воды, выдерживают 40 - 60 мин, нагревают, не доводя до кипения, при непрерывном помешивании до получения прозрачного раствора желатина. Далее в пробирку 1, содержащую субстрат, вносят раствор жетатина 1,0 мл и раствор Люголя 1,0 мл.Раствор Люголя готовят предварительно по прописи: кристаллического йода 1 г, йодистого калия 2 г, воды дистиллированной 300 мл. Сначала растворяют в небольшом количестве воды йодистый калий, после чего добавляют кристаллический код. По растворении смеси прибавляют дистиллированной воды до 300 мл.Раствор в пробирке 1 тщательно перемешивают и получают йодкрахмальную индикаторно-субстратную пленочную смесь черного цвета, которую наносят с помощью пипетки-дозатора каплями объемом 0,04 мл на гидрофобную поверхность бумаги, покрытой полимерной пленкой.Таким образом, при расчете в массовых единицах йодкрахмальная индикаторно-субстратная микропленка содержит крахмала 0,0004 г, желатина 0,0004 г, кристаллического йода 0,0033 г, йодистого калия 0,0066 г на 0,04 мл дистиллированной воды.Бумагу с нанесенными кпями оставляют при комнатной температуре на 18 - 24 ч, затем выдерживают в термостате при 35 - 45 С до полного высыхания и образования автономных йодкрахмальных индикаторно-субстратных микропленок черного цвета, которые отделяют от поверхности бумаги. Микропленки собираясь и хранят во флаконах при комнатной температуре в течение 2 лет (срок наблюдения).Для определения амилазной активности рубца жвачных животных в пробирку приливают 0,5 мл надосадочной или отфил ьтрованной части рубцового содержимого. Затем вносят йодкрахмальную индикаторно-субстратную микропленку черного цвета с помощью бактериалогической петли, смачивают и прикрепляют ее к стенке пробирки, инкубируют при 37-39 С до полного обесцвечивания микропленки (до 30 мин). Наблюдения за сменой окраски микропленки осуществляют визуально через стеклянную дверь термостата с целью поддержания постоянной температуры. Расчет результатов амилазной активности рубцового содержимоя производят по формулеА мг - - амилазная активность ( ) Б мин где А - количество крахмала, содержащегося в микропленке,мг;Б - время полного расщепления крахмала микропленки, мин.Результаты представлены в табл. 1.П р и м е р 2. Способ осуществляют в соответствии с примером 1, варьируя содержание компонентов в составе микропленки,Результаты представлены в табл, 3.Из табл, 3 следует, что оптимальным соотношением крахмала, желатина, кристаллического йода и йодистого калия в составе микропленки является соответственно, мас. О 0,0004:0,0004:0,0033:0,0066 на 0,04 мл дистиллированной воды. Формула изобретения Способ определения амилазной активности рубца жвачных животных, предусматривающий инкубацию рубцовой жидкости с крахмалом в качестве субстрата, оценку расщепления крахмала по реакции с йодсодержащим реактивом и последующий расчет количества крахмала, расщепленного в единицувремени,отличающийся тем, что, с целью ускорения, упрощения и удешевления способа, инкубацию с крахмалом и оценку его расщепления осуществляют одновременно путем внесения в рубцовую жидкость крахмала и йодсодержащего реактива в виде йодкрахмальной индикаторносубстратной микропленки, содержащей крахмал, желатин, кристаллический йод и йодистый калий при массовом соотношении компонентов соответственно 0,0004:0,0004;0,0033:0,0066 на 0,4 мл дистиллированной воды, и последующей инкубации до полного обесцвечивания микропленки.1634717 Таблица 1 П р и м е ч а н и е, В 1 микропленке содержится 0,4 мг крахмала,Таблица 2 Способ Известный Предлагаемый 249,396 мг Реактивы и аппаратура, необходимые для осуществления способовКалий фосфорнокислый двухщамещенный, мгКалий фосфорнокислый одноэамещенный, мгКрахмал растворимыйРаствор Люголя, мл1 н. раствор соляной кислоты, млЖелатин, мгФотоэлект около имет 04 мг 0,004 0,4 Не т еб ется