Способ определения активности тканевого тромбопластина

(9 5)5 0 01 М 33/8 МИТЕТОТКРЫТИЯМ ГОСУДАРСТВЕННЫИПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ВМ 603 ЯМ ЮИОВ 37 ЕЖМИМкЛ%23суда рс нный медици Левен, О.А.Тементьева ий, П,И и И.А, 8)оэср. (Ято е 2,ч.48, М ЕЛЕНИЯ АКТИВНООПЛАСТИНАтносится к медиципределения активнастина. Целью изо И не и ости брек медицине. ася способа оппластина.(71) Тюменский гоский институт(54) СПОСОБ ОПРЕТКАНЕ ВОГО ТРОМ(57) Изобретениекасается способатканевого тромбо Изобретение относитсяименно к биохимии, и касаетределения тканевого тромбоЦель изобретения - упрощение способаэа счет замены труднодоступных реактивов.На чертеже показан график для иллюстрации предлагаемого способа,П р и м е р 1. 1, Из 100 мг сырой тканипечени крысы получают гомогенат иэмельчением навески в гомогенизаторе стеклостекло со скоростью 3000 об/мин, 5 мин вприсутствии 1 мл 0,14 М раствора хлориданатрия. Гомогенат центрифугируют при ускорении 400 х о.10 мин, надосадок центрифугируют с ускорением 145000 х 9, 60 мин,супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 10 мл 0,14 М раствора хлориданатрия и повторяют центрифугирование,Надосадок отбрасывают. а осадок ресуспендируют в 1 О мл того же растворителя(взвесь тканевого тромбопластина). 0 1658097 тения является упрощение способа за счет замены труднодоступных реактивов. Способ осуществляется путем инкубации плазмы с источником тромбопластина, определения времени свертывания плазмы и построения калибровочной кривой зависимости времени свертывания от количества тромбопластина, В качестве контрольной пробы используют пулированную нормативную донорскую плазму, предварительно насыщенную неполным тромбопластином (коммерческим эритрофосфатидом). Способ позволяет исключить из определения апопротеин 111, а также фактор 1 Х-дефицитную плазму, 1 ил. 3 табл. 2, К 0,1 мл пулированной донорской плазмы (от четырех доноров) добавляют 0,1 мл взвеси эритрофосфатида (0,8 мгlмл), 0,1 мл 0,14 М раствора хлористого натрия и 0,1 мл 0,025 М раствора хлорида кальция - определяют время свертывания (Т,), которое оказалось равным 103 с.3, К 0,1 мл той же пулированной плазмы 00 добавляют 0,1 мл взвеси эритрофосфатида О (0,8 мг/мл), 0.1 мл взвеси тканевого тром- К) бопластина и 0,1 мл 0,025 М раствора хлорида,4 кальция - определяют время свертывания (То) - оно оказалось равным 22 с. Отношение Т/То оказалось равным 4,68, что выпадает иэ интервала 2 - 4, В связи с этим исходную ь взвесь тканевого тромбопластина разбавляют в 10 и 100 раз, проводят определения согласно п. 3 с обоими разведениями и устанавливают, что время свертывания равно 49 и 85 с соответственно для разведения в 10 и 100 раз, 103/49 и 103/85 равны соответственно 2,1 и 1,2. Первое значение лежитв интервале от 2 до 4 и используется для расчета.Расчет: на графике находят, что значению Тк/То, равному 2,1, соответствует активность тканевого тромбопластина в пробе, равная 1,05 ЕА. Умножают эту величину на 10 (приведение к 1 мл) и на 100 (разведение осадка в 10 и еще раэ в 10 раэ), а также на 10 (приведенные к 1 г сырой ткани). Результат - 10500 ЕА/г сырого вещества,П р и м е р 2, 1, Навеску ткани легких крысы помещают в гомогениэатор стекло- стекло и измельчают (3000 об/мин, 5 мин) в присутствии 1 мл 0,14 М раствора хлористого натрия. Гомогенат центрифугируют 10 мин с ускорением 400 х 9, отделяют надосадок и центрифугируют его 60 мин с ускорением 145000 х 9, отбрасывают надосадок, суспендируют осадок в 10 мл 0,14 М раствора хлористого натрия, повторно центрифугируют в тех же условиях, отбрасывают надосадок, а осадок ресуспендируют в 10 мл того же растворителя (взвесь тканевого тромбопластина).2. К 0,1 мл пулированной донорской плазмы добавляют 0,1 мл взвеси эритрофосфатида (0,8 мг/мл), 0,1 мл 0,14 М раствора хлористого натрия и 0,1 мл 0,025 М раствора хлорида кальция - определяют время свертывания (Т) 96 с. 3, К 0,1 мл пулированной плазмы добавляют 0,1 мл взвеси эритрофосфатида (0,8 мг/мл), 0,1 мл взвеси тканевого тромбопластина (иэ. п.1) и 0,1 мл 0,025 М раствора хлорида кальция - определяют время свертывания (Т) 27 с, Отношение Т/Т = 3,43, т.е. располагается в интервале между 2 и 4, следовательно, используется для расчета.Расчет с помощью калибровочного графика показывает, что величина 3,4 (отношение Тк/Т) соответствует 2,2 ЕА, Умножив это значение на 10 (приведение к 1 мл) и на 100(10 - приведение к 1 г сырого вещества, 10 - разведение исходного вещества), получают 2200 ЕА/г сырого вещества. Воспроизводимость определений (о /М хх 100) при 10 повторностях составляет 4,2,Конкретно для 1 О параллельных определений активности тканевого тромбопластина5 в ткани печени средняя величина равна10210 ЕА/г сырой ткани (о) - 428,8,В табл,1 показана сравнительная характеристика трудоемкости получения некоторых реактивов, используемых в предлагаемом10 и известном способах,В табл.2 показана сравнительная характеристика материалов и аппаратуры,используемая в известном и предлагаемомспособах.15 В табл,3 показана тромбопластическаяактивность ткани мозга человека в условныхединицах активности (ЕА) на 1 г сырой ткани,Иэ данных табл.З видно, что результаты,полученные с помощью предлагаемого спо 20 соба, в достаточно концентрированных материалах не уступают по воспроизводимости ичувствительности результатам, полученным спомощью известного способа, При сильномразбавлении (1:20) воспроизводимость да 25 же несколько выше в случае использованияпредлагаемого способа - отклонение от Муменьшено с 12,5 (известный) до 11,5(предлагаемый).Предлагаемый способ позволяет эаме 30 нить апопротеин 1 И, а также факторХ-дефицитную плазму, для получения которойнеобходимо располагать больными с дефицитом этого фактора.Формула изобретения35 Способ определения активности тканевого тромбопластина путем инкубацииплазмы с источником тромбопластина вопытной и контрольной пробах, определения времени рекальцификации плазмы и40 построения калибровочной кривой зависимости времени рекальцификации от количества тромбопластина, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения способа эа счетзамены труднодоступных реактивов, в каче 45 стве контрольной пробы используют нормальную донорскую плазму, насыщеннуюэритрофосфатидом.Измельчение исследуемого материалаСолюбилизация и отделение надмолекулярных частицОсвобождение надмолекулярных частиц отпримесей (отмывание)Диализ и хроматографияВыделение фосфолипидовРекомбинация тканевого тромбопластинаО енка активности тканевого т омбопластина 8 ч Отсутствует 7 ч 48 ч 1 ч 10 минизвестного Материалов 5,Единиц аппаратуры - 3 Итого: Материалы - 13 наименований, из них 5 труднодоступных, (8-10, 12и 13) Единиц аппаа ы 7 1 2 3 4 5 6 7, 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Материалы и аппаратура Исследуемая тканьВероналовый буферНатрия дезоксихолатТрис-буферНатрия хлоридКальция хлоридТритон Х 100Сефадекс ДЭАЭ-А 50Ультрагель АсА 44Амикон РМ Растворители органическиеФактор- Х дефицитная плазмаКоммерческий тромбопластинЭритрофосфатид коммерческийМикрораэмельчитель тканейЦентрифуга лабораторнаяУльтрацентрифугаДиализаторНаборы для колоночной хроматографииРоторный испарительГене ато льт азв ка Показатели ля способа Ха акте истика я способа1658097Таблица 3 О бЯИ ЮОЖ ООИ ОМ Ролц, арокбоаласвона, ма/мСоставитель С.Мельниковаедактор А.Коэориэ Техред М. Моргентал Корректор Т,Палий акаэ 1712 Тираж 420 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб,. 4/5Проиэводственно-иэдательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101