Способ определения активности эпоксидгидролазы

5679 1 СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУ БЛИН 19) (1(51)5 0 01 И 30/04 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТ ЕЛЬСТВ РСКОМУ СЕИД КА техноАс 1 а РЬч, 58,тносится к биотех логиизл та ие споительносОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ П 1 НТ СССР(71) Институт питания АМН СССР(56) Сотниченко А.И Сердюк О.А. идр, Хроматографический метод опреде: гния активности мембранной эпоксидгидролазы. - Антибиотики и медицинскаябиотехнология. Т. 30, 1985, 11 7,с. 535-538.БсйоЕе 1 В., Чпсге 1. аг,шасо 1 еС Тох 1 со, 1986,р. 156-158,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИЭПОКСИДГИДРОЛАЗЫ обр. тение оимситбьения активок ситканях.ель изобретения - упрощи увеличение его чувст)ть использовано дляности и свойств,фермеьл азы в р аз личных ор г а тиСпособ заключается в том, что после проведения ферментной реакции образовавшийся фенилэтиленгликоль (ФЭГ) экстрагируют иэ инкубационной смеси н-бутиловым спиртом,.аликвоту бутаноля без предварительного концентрирова ния подвергают анализу методом ВЭЖХ в системе гексан-иэопропиловый спирт- вода (80:28:2) и проводят детектирова ние ФЭГ при лл. волн.:; и, и.(57) изобретение относится к био логии и может быть использовано для изучения активности и свойств фермента эпоксидгидролаэы в различных органах,и тканях, Целью изобретения является упрощение способа и увеличение его Чувствительности и точности. Способ заключается в том, что после проведения ферментной реакции образовавдийся продукт-фенилэтиленгликоль(ФЭГ) экстрагируют иэ инкубационной смеси н-бутанолом, апиквоту бутанола без предварительного концентрирования по вергают анализу методом ВЭЖХ в системе гексан-изопропиловый спирт-вода (76-84):(26-30):(1,8-2,6) и провбдят детектирование ФЭГ при длине волны 210 нм. 4 табл . Способ осуществляется следующим О образом.В инкубационную смесь, состоящую из 0,15 М трис-НС 1 буфера (рН 8,7) и ферментного препарата (микросомы), вносят стиреноксид, растворенный в ацетонитриле, После инкубации при 37 С пробы переносят в ледяную баню, добавляют н-бутиловый спирт и насыщенный раствор (ИН)гБО, встряхивают и аликвоту бутилового спирта отбирают для хроматографического анализа, Для определения уровня неферментного д гидролиза стиреноксида параллельно опытным ставят контрольние пробы, отличающиеся от них только тем, что ферментний препарат предварительно подовергают нагревав 61 лри 100 С в тече 1567971ние 5 мин. Для анализа алкивот бутилового спирта на содержание фЭГ используют жидкостный хроматограф колонку с силикагелем П 1 СгаярЬеге - я в5качестве подвижной фазы используютсистему гексан - изопропиловый спиртвода (ЯО:28:2) при скорости потока1,5 мп/мин. Обнаружение ФЭГ осуществляют с помощью УФ-детектора при дли Оне волны 210 нм. Количественное определение фЭГ проводят с помощью интегратора с использованием внешнего стандарта ФЭГ,Активность эпоксидгидролазы (А)рассчитывают по формулеРо-РкА= -- (нмоль/мин на 1 мг белка),Сщгде Р - количество ФЭГ, образовавшееся в опытных пробах, в результате ферментного гидролиза, нмоль;Р - количество фЭГ, образовавшееся в контрольных пробах нрезультате неферментного гид ролиза;С - врЕмя инкубации, мин;щ - количество белка, внесенногов инкубационную смесь, мг.П Р и м е Р 1, Определение активности микросомальной эпоксидгидролазыпечени крыс.Для выделения фракции микросом печень После декапитации животных немедленно извлекают, тщательно промывают 0,154 М КС 1, измельчают путем продавливания через перфорированную пластину и гомогенизируют в гомогениэаторе Поттера-Эльвейема (тефлон-стекло,1200 об/мин, 90 с), используя в качес 40тве среды для гомогенизации 0,154 МКС 1 содержащий 50 мИ Трис-НС 1 (рН7,4) в отношении 1:3 (вес/объем). Всепроцедуры проводятся при 4 С, Гомогенаты подвергают центрифугированию при 4510000в течение 20 мин при 4 С, Надосадки переносят в центрифужные охлажденные пробирки и подвергают центрифугированию при 105000 в течение60 мин. 11 олученный осадок - фракцию50микросом ресуспендируют в среде, используемой для гомогенизации нз расчета: частицы иэ 1 г ткани в Я мл средыВ опытные пробирки добавляют 0,34 мл0,15 М трис-НС 1 буфера (рН 8,7) и0,05 мл суснензии микросом, прогре-дают н течение 2 мин при 37 С на нод,оной бане, после чего вносят 0,01 мл 50 мМ стиреноксида растворенного вацетонитриле. В контрольных пробирках суспензию микросом перед добавлением нагревают при 1 ОО С в течение 5 мин,Опытные и контрольные пробирки инкубируют в течение 15 мин при 37 С,затем переносят н ледяную баню и добавляют по 1 мл н-бутилового спиртаи 0,5 мл насыщенного раствора(ИН) БО встряхивают в течение 10 си отбирают по 5 мкл н-бутилового спирта для хроматографического анализаЦляанализа использован жидкостной хроматограф "А 1 Сех" модель 332, колонка (25 см46 мм) и предколонка (4,5 см 46 мм)с силикагелем ЮгаярЬеге-я (размерчастиц 5 мкм) в качестве подвижнойфазы использую. систему гексан - изопропилоный спирт - вода (80:28:2)при скорости потока 1,5 мп/мин. Обнаружение ФЭГ осуществляли с помощьюУф-детектора КгаСоя-БРпри длиневолны 210 нм (0,005 АРБ конст. времени 0,5 с), Время удерживания составляет для фЭГ 4 мин, Количественноеопределение ФЭГ проводят с помощьюинтегратора "ЛЬщМ 7 ц С-НЭА" с использованием ннещнего стандарта (коммерческого поепаата ФЭГ),Лредел обнаружения ФЭГ согласноспособу составляет 5 нмоль во вколе.Расчет активности эпоксидгидролазы: количество ФЭГ, образовавшегосяв результате ферментного гидролиза(Р ), составляет 17,7 нмоль; количество ФЭГ образовавшегося в результатенеферментного гидролиза (Рк)составляет 1,6 нмоль; время инкубации 15 мин.Количество микрогомального белка,добавленного в пробу, составляет0,12 мг17,7-1,6А=4=8 94 нмоль/мин на150 121 мг белкаРезультаты пяти параллельных определений представлены в табл. 1 Среднее значение согласно табл.1актив но сти э пок сид гидр ол азы с о с т анл яет 9,54 нмоль/мин на 1 мг белка, коэффициент вариации метода 377,П р и м е р 2, Определение степени извлечения ФЭГ,В пять пробирок содержащих0,34 мл 0,15 М Трис-НС 1 буфера (рН8,7) и 005 мп суспензии микросом,добавляют 6 мкг (43,5 нмоль ФЭГкоммерческий препарат) в 001 мп аце15679 Таким образом, степень иэвлечетияФЭГ из инкубационной смеси составляет92,2+0,8%П р и м е р 3, Определение степениизвлечения ФЭГ в отсутствии сульфатааммония и при его разных соотношениях.В 8 пробирках, содержащих по0,34 мтт 0,15 М Трис-НС 1 буфера (рН8,7) и 0,05 мл суспензии микросом,15добавляют 6 мкг (43,5 нмоль) ФЭГ (коммерческий препарат, в 0,01 мп ацетонитрила, Экстракцию и количественноеопределение ФЭГ проводят как в при мере 1, добавляя и каждые 2 пробиркиразный объем насыщенного водного раствора сульфата аммония (4 определенияв двух повТорениях),Результаты определения представлены в табл. 3,сидгидролаэы, предусматривающий выделение микросомной фракции иэ клетокпечени, проведение ферментной реакциисо стиреноксидом, выделение продуктовреакции экстракцией органическим растворителем, их идентификацию и количественную оценку методом ВЭ,КХ, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цел .упрощения способа и увеличение егочувствительности, выделение продуктовферментативной реакции осуществляютэкстракцией н-бутанолом в присутСтвиисульфата аммония, а при идентификациии количественной оценке методом ВЭЖХапиквоты бутанольного экстракта используют силикагельную фазу и систеии растворителей гексан-иэопропанол вода при объемном соотношении растворителей 76-84:26-30;1,8-2,2 с Уф-детектированием при длине волны 210 нм.т Т аблиц а Таким образом, максимальная степень извлечения (92,37) ФЭГ наблюдается при -использовании в процессе экстракции 0,5 мп насыщенного раствора 30сульфата аммония, Близкие значениястепеней извлечения наблюдаются и прииспользовании больших количеств раствора сульфата аммония, однако изэкономических соображений в способеиспользуют минимальный его объем. П р и м е р 4. Определение активности микросомальной эпоксидгидролаэыпечени крыс при различном соотношениикомпонентов подвижной фазы,Выделение микросом и определение,активности зпоксидгидролизы проводят,как в примере 1 но при соотношенияхкомпонентов, приведенных в табл, 4, 45 А, нмоль/мин намг белка Рке нмольРнмоль 894 1,6 17,7 9,88 1,9 19,7 9,67 1,6 9,0 9,55 1,6 18,8 9,67 1,6 тонитрила, Экстракцию и количественное определение ФЭГ проводят, как в примере 1,Результаты содержания ФЭГ сведе 5 ны в табл, 2. 71 6Приведенные подвижные фазы харак=териэуются приблизительно одинаковымвременем удерживания ФЭГ., Форма пиков ФЭГ - правильная (распределениеГаусса), за пределаья укаэанных соотношений компонентов, время удерживания может значительно изменяться, пикФЭГ уширяется приобретает "перегибы",три уменьшении доли воды в подвижнойфазе происходит раздвоение пика ФЭГ,что объясняют возрастанием роли конкурентного адсорбционного механизмахроматографии ( на активных центрахсиликагеля) по сравнению с распределительным (в планке воды),Таким образом, оптимальным является соотношение компонентов подвижной фазы гексаниэопропанол вода 76-84; :26-30;1,8-2;6,Формула изобретения Способ определения активности эпок1567971 Т а бл н ц а 2 Степень извлечения, Е Пробир- ФЭГ, нмолькаФ 93,3 92,7 89,0 93,4 92,6 Таблица 3 Среднее значение стеПробир- Объем добавленка, У ного растворасульфата аммониямп пени извлечения ФЭГ, Х 78,7 0 1-2 3-4 92,3 0,5 89,9 07 92,0 1,О 7-8 Т аблица 4 Состав под- Соотношение викной фазы к,",понентов Время удержания, юн Гексан-изопропанол-вода 76:26:1,8Составитейь А. СеменовТехред М.Ходанич Корректор П, Муска Редактор М.Келемещ Заказ 1320 Тирак 494 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5Производственно-иэдательскиЯ комбинат "Патент", г.укгород, ул. Гагарина,10 То ке То ае 41,01 40,33 38,70 40,65 40,29 80;28:284.30,2,2 3,8-4,6 3,8-4,6 3,8-4,6