Способ выявления возбудителя чумы

/53 1 04 1)5 С ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ едотельроб ". ьян,и Н. По н ммуных 1982 их чум тов, ДИТЕЛЯ обр кро осится к м может быт биологичесицинолог ко й диольэовано и гностике чу ми ругих особо с СУДАРСТЕ)ЕННЫЙ НОМИТЕТ ИЗОЬРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМИ ГННТ СССР(56) Наставление по примененоглобулийов диагностическлюминесцирующих сухих, Сара(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУЧУ 1"Ы(57) Из етение отн Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для диагностики чумы.Целью изобретения является ускорение и повышение чувствительности способа.П р и м е р 1, В центрифужную пробирку объемом 11 мл добавляют последовательно 1 мл 1007 глицерина рН 7,2-,4 окрашенного каким-либо кра. сителем (метилвиолет, конгорот.и т,д.), наслаивают 0,5-1 мл эабуференного 807 глицерина рН ,2-7,6, добавляют 5 мп исследуемой пробы, подозрительной на зараженность бактериями чумЫ, в которую преднарительно вносят чумные диагностические люминесцирующие иммуноглобулины до рабочей концентрации, которал соотнетстнет 1:50 для иммуноглобул;н 1 он с рабочим титных инфекций. Целью изобретения является ускорение и повышение чувствительности способа, При исследованииобъектов внешней среды на наличиевозбудителя чумы применяется центрифугирование в градиенте плотностиглицерина. Пробы предварительно обрабатывают специфической люминесцирующей сывороткой; В результате чего достигается концентрация микробов в объеме 803 глицерина с одновременнойокраской их люминесцирующими иммуноглобулинами. Посторонние частицы, имеющие плавучую плотность большую посравнению с плотностью возбудителячумы, оседают на дно центрифужной пробирки. 3 табл. ром 1:8 (для иммуноглобулинов с титром 1:16 и 1:32 рабочая концентрациисоответствует разведению 1:100, а дляиммуноглобулинов с титром :64 рабочей концентрацией является разведение 1:150). Затем пробу инкубируютпри комнатной температуре в течение3-5 мин и. центрифугируют 10 мин нацентрифуге с ротором диаметром 180 мьпри 5000 об/мин (2500 д),После центрифугирования четко разграничинаются три слоя: верхний5 мл надосадочной жидкости; средний - 0,5-1 мл эабуференцого 802 глицерина, который содержит микробцыеклетки и нижний - 1 кл ООЛ глицерина с посторонними частицами (земля,песок, пыль и т.д.). Лля дальнейшегоисследонания с по;ушью лнпсткн Ласгера, шприца илц интим п сс.сй пц 15490771Из представленных результатов следует, что способ является более эффективным по сравнению с общепринятым при ускоренной диагностике возбудителя чумы, т,к. среднее число светящихся бактерий, выращенных при 37 С в 10 полях зрения при общепри- " нятом методе исследования составляет 2+0,3 при исходной концентрации 10 м.кл. результат отрицательный,7При разработанном методе число светящихся микробных клеток составляет 14+3 и 20,2, соответственно, что в 7 раэ эффектнее.Среднее число светящихся бактерий, ьвыращенных при 28 С в 10 полях зрения при исследовании разработанным методом составляет 1,2+0,2 и 2+ при исходной концентрации микробов310 и 10 м.кл, в 1 мл соответстнен.но, а при исследовании общепринятым методом результат отрицательный. 40 50 петки отбирают средний слой О,5- мл забуференного 8 ОЕ глицерина, содержащий микробные клетки и помещают н сте. рильную пробирку. Затем из этой пробы отбирают материал для посева на питательные среды, для заражения ла" бораторных животных и петлей 9 2 делают мазки на обезжиренном предметном стекле. Мазки закрывают покровным стеклом, на края которого наносят расплавленный парафин таким образом, чтобы образовалась герметическая камера, помещают в крышку чашки Петри и просматривают - од люминесцентным микроскопом, отмечая количество микробных клеток и степень специфического свечения. От начала до конца исследования занимает 16-18 мин.П р и м е р 2Способ ускоренного выявления нозбудителя чумы апробирован в следующих условиях: в 2 чашки Петри помещают садовую землю (2 г), затем в каждую нносят по 5 мп взвеси Легзпа резз в физиологическом растворе концентрацией 10 и 10. м.кл. в 1 кп. Культуру выращива 8ют на агаре Хоттингера в течение 48 ч при 28 и 37 С.Чашки помещают в термостат прио28 С до полного высыханияЗатем с чашек делают смыв 10 мл забуференного физ. раствора рН 7,2-7,4. Всего проведено 10 опытов. Результаты (сводные данные по 10 опытам) представлены втабл. 1.35 П р и м е р 3. Проведено испытание активности, чувствительности и специфичности способа в сравнении с традиционным методом флуоресцирующих антител.Результаты испытания активности и чувствительности представлены втабл, 2; специфичности в табл. 3. Установлено, что предложенный метод по своей актинности превосходиттрадиционный метод, т.к. при его применении интенсивность свечения клетокштамма 3. резз Е.В. как выращенного при 28 С, так и при 37 С, а также сухой вакцины ЕВ возрастают на эдинпорядок.Чувствительность заявленного метода при исследовании минимальных концентраций (110 м.кд. в мл) микробных клеток штамма Л. резз ЕВ, выращенных при 28 С и 37 С в 3 раза вьппе, чем у общепринятого метода (см табл. 2). Специфичность заявленного метода исследована с помощью возбудителя псевдотуберкулеза (шесть эталонных штаммов серотипв 1, 11, 1111 Ч, Ч, Ч 1) и кишечного иерсиниоэа штаммы - 97,373 н концентрациях 1 1 О ; 1 10510 и 5 10 м.кл. в мл аУстановлено, что при изучении специфичности заявленного и общепринятого способов заметного расхождения результатов не отмечено (см. табл. 3).Предлагаемый способ по своей активности и чувствительности превосходит общепринятый метод флуоресцирующих антител, не отличаясь от него по своей специфичности. Способ может быть использован с целью индикации возбудителя чумы в смывах с объектов внешней среды.Формула изобретенияСпособ выявления возбудителя чумы, включающий центрифугирование исследуемого материала, приготовление мазкаобработку специфическими люминесцирующими иммуноглобулинамн с последующей микроскопией, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения н повьппения чувствительности способа, перед центрнфугированием люминесцирующне иммуноглобулины вносят в исследуемый материал, центрифугирование полученной смеси осуществляют в градиенте плотности глицерина, а для приготовления мазка используют слой ЯОЕ глицерина,с 1549077 Т а б л и ц а 1 Общепринятый метод Предлагаемый метод выращивания чумного микробат С Температура 37 28 37 28 Количество микробных клеток в О полях зрения (среднее арифметич,) и интексивность свечения т1 О 0ОП 2+0,3 теблнла 2 Обнепрннаттд нетод Предлзгаемма метод Птэзоттемпе раттраемраннзаннл, С Еонлентракнз е проба, м.кл+Ф на лэ стаоноле эренн 6 35 44сбе ЕЬ ФФ 4 1 О 4 Ф-Ф н. кл э лопе тренк44 ФФФФФ +ФФФ В м.кл 6 ФФФ 444 един +ФФФ 5 1 О 1 1 О 6 Л,2 Стк опа ере 4+Фопн стаои ФФФ е пола ФФФ лэяе колнчестэо м.кл э пола эрен В м,клннл4+ 2 м.клФФ Фи кл 11 н.кл 6 м.кл44 Ф 4+ ФФФ+444 +4 м,кл э пола эргнн ФФФ елннне нме Ф 6-5 м.кл4+Ф з поле зреннк пале зреннз Концентрациямикробных хлеток в пробе(м,кл, вклобъем 5 ип) реесбе ЕЬ/32 раеСЕЬ 32к зеканна ЕЬ ЕЬ разеа ЕВ/2 ВфЧффЧ Чсч- м.м мммм ф лффл СЧ ЕИСЧЕ ес с е с нл л л мс л 1. 1 311 1вел а1 1 3 1 1 1 е 1