Способ определения степени цитопатогенности нейссерий

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскнхСоцнапнстнческниРеспубпнк и 958496(5)М. Кл. С 12 й 1/ОО зЬеударетеапай квинтет СССР ио делам изобретений и открытий(088.8) Дата опубликования описания 15,09.82(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ЦИТОПАТОГЕННОСТНЕЙССЕРИЙ, н подсчет количества деген еток проводят через 6 и 24 Йэобретение относится к медицине, а именно микробиологии.Известен способ определения степени цитопатогенности нейссерий путем инфицированияклеточной культуры. сусцензией микроорганизмов с последующим подсчетом количествадегенерированных клеток 11).Однако известный способ является длительным и недостаточно чувствительным.Цель изобретения - ускорение и повыше.ние чувствительности способа,Укаэанная цель достигается тем, что соглас.но способу определения степени цитопатогенности нейссерий путем инфицирования клеточной культуры суспензией микроорганиз1 змов с последующим подсчетом количествадегенерированных клеток в качестве клеточной культуры используют однослойную культуру перевиваемого амниотического эпителиячеловека, предварительно синхронизированнуювыдерживанием при 10 Ю,1 С в течение 3 ч,при этом инфицирование проводят последовательно суспензией микроорганизмов, содержащей 2,106+1 4 104 и 8,102 8, 104 робных тел/млрированных кл ч инкубации.П р и м е р 1, Готовят однослойную 18-часовую культуру клеток в пробирках при посевной дозе 400000 - 50000 клеток на мл. среды, используя маточную перевиваемую культуру амниотического эпителия человека общепринятым методом. Для выра. щивания клеток используют среду 199 с ,10% сыворотки крупного рогатого скота и. антибиотиками (пенициллин 100 ЕД/мл, стрел томицин 50 ЕД/мл). Штатив с пробирочными 18-часовымн культурами клеток помещают в рефрижератор с температурой 10 С на 3 ч для синхронизации клеточной культуры.Испытуемую. культуру нейссернй 16 - 20- часового роста на сывороточном агаре Хоттингера смывают физиологическим раствором (рН 7,0 - 7,2) и готовят мнкробные взвеси 20 ЕД и 5 ЕД по национальному стандарту ГИСК, что соответствует 2 109 и 510 микробных тел в 1 мл. Перед заражением в культуре клеток проводят смену ростоСоставитель Е, ЯрныхТехред Т, Фанта Корректор Г. Огар Редактор М. Келемеш Заказ 6983/37 Тираж 505 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП фйатент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 95вой среды на поддерживающую среду 199 безсыворотки и антибиотиков. Затем приготовленные микробные взвеси испытуемого штамманейссерий в объеме 0,4 мл вносят в 3 -4 пробирки с клеточной культурой, т,е. по8 е 10 а и 210 В микробных тел на пробиркус культурой клеток, Доза 810 микробныхтел вызывает четко выраженный цитопатичеький эффект через б и 24 ч после зараженияклеток в зависимости от степени вирулентности испытуемых штаммов менингококка ине дает ответной реакции клеток в случае,непатогенных нейссерий. Доза с содержанием210 микробных тел является пороговой.для менингококков при наблюдении через24 ч после заражения и ареактнвной длянепатогенных нейссернй.Для контроля клеточной культуры оставляют 4 пробирки с поддерживающей средой, незараженными, Опытные и контрольные пробирки инкубируют при 37 С в течение 24 ч.Через 6 ч проводят первое чтение пмтопатического эффекта, наблюдая опытные клеточные культуры в сравнении с контрольныминод микроскопом при малом увеличении(об. 8 х, ок. 10 х), Цитопатический эффектоценивают по четырехкрестовой системе соответственно проценту погибших клеток: 100%, 75% , 50%, 25%(+) клетокмонослоя. Отсутствие цитопатического эффекта обозначают знаком (-), Через 24 ч прово.дят второе чтение результатов,Определение степени цитопатогенностн испытуемого штамма нейссерий проводят по от.ветной цитопатнческой реакции на обе днфференцирующие дозы нейссерий с учетом срокаее развития (6 ч или 24 ч). Высоковирулентными менннгококками считаются те, которые через 6 ч вызывают дегенеративные иэ.менения у 75 - 100% клеток (для свежевьще 8496 4ленных штаммов) илн через 24 ч (для хранившихся штаммов). Вирулентными считают.ся штаммы менингококков, обусловливаю.щие гибель 25 - 30% клеток на 24 ч, авирулентными - штаммы, не вызывающие цмто.патнческого эффекта В контрольных пробирках дегенеративные изменения отсутствуют.Способ определения степени цитопатогеннооти нейссерий апробирован при изучении 16 1 в эталонных и 124 свежевыделенных штаммовнейссерий,Использование изобретения позволяет улуч.шить диагностику менингококковой инфек циие13 Формула изобретения Способ определения степени цитопатогеннооти нейссерий путем инфицирования клеточнойкультуры суспензией микроорганизмов споследующим подсчетом количества дегенериро.ванных клетЬк, о:т л и ч а ю щ и й с я,тем, что, с целью ускорения н повьппениячувствительности способа, в качестве клеточ.ной культуры используют однослойную культуру перевиваемого амниотического эпителиячеловека, предварительно синхронизированнуювыдерживанием при 10 Щ 1 С в течение 3 ч, 36при этом инфицироваиие проводят последова.- тельно суспензией микроорганизмов, содержвщей 210 в 1,4 104 и 810628.104 микробных тел/мл, и подсчет количества дегенерированных клеток проводят через б и 24 чинкубации.ЗЗ Источники информации,принятые во внимание нри экспертизе1. Дударева В. В. Менингококковая инфекция, Труды ЛСГМИ, Л., 1978, с. 63 - 65,