Способ определения нейровирусов в спинномозговой жидкости

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИН А 1 2 19 51) 4 0 01 И 33/5 121/06 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНАВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ициова ироинтвиологии и Вотякоер,цкая й ульту мозга обра,5 адус А.К,усных нейро984. инкубаци ны вируса Предва клетокельнос ань нов ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) Баринский И,(ь ЩубЭтиология хронических виинфекций, М.; Медицина,Изобретение относится к медицине.Целью изобретения является повышение чувствительности способа,Способ осуществляют следующимобразом,Для обнаружения вируса использовались первичные культуры нейроновспинного и головного мозга эмбрионов(12-14- и 16-18-суточные, соответственно) крыс, приготовленные следующим образом. Беременные крысы соответствующих сроков беремнности помещались в атмосферу углекислого газа-,наркотизировались и забивались переломом шеи. После извлечения эмбриоих помещали в раствор Хэнкса,отмывали в нем, затем у эмбрионоввскрывали спинно-мозговой канал или(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙРОВИРУВ СПИННО-МОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ(57) Изобретение относится кне, а именно к диагностике нфекций. Цель - повышение чувтельности способа. Для обнарнейровирусов в спинно-мозгокости используют первичныенейронов спинного и голонноэмбрионов крыс, предварителботав их средой "Игла" с рНв течение 30-60 мин. Послев нейронах выявляют антигеиммунопироксидазным методомрительная обработка культурприводит к повышению чувствти способа на 20 . черепную коробку, извлекали спиннойили головной мозг. Мозг очищали отоболочек, измельченная мозговая ткмногократно пипетировалась пастеровскими пипетками различных диаметров(от большего к меньшему), В течение5 мин пробирка со взвесью клетокотстаивалась для осаждения на днокрупных кусочков ткани, супернатантсобирался и наносился на покровныестекла, предварительно покрытые коллагеном. Затем культуры помещались втермостат при 37 С. Культивированиевели в чашках Петри. Исследование спинно-моэ говои жидкости (СМЖ ) на культуре клеток проводили следующим образомВ 10-14-суточных культурах клеток .ростовая среда изымалась и вносиласьминимальная среда Игла" (МЕМ 1 с добавлением глюкозы до 600 мг/7. (рН6,0-6,5) на 1 ч. Затем культуры переносили в ростовую среду 1 МЕМ 807.сыворотка плацентарной крови человека 107; лошадиная сыворотка 107глюкоза 600 мг/7.) и добавляли к ней107, СМЖ. Через 1-5 сут. стекла скультурами извлекали из среды роста,промывали 5 мин в физиологическомраствореподсушивали феном и фик- .сировали в охлажденном до +4 С ацетона 7 мин. После фиксации стеклаотмывали 2 раза по 3 мин в физиологическом растворе и погружали на 10 минклетками вверх) в раствор азида натрия (0,001 М ) с добавлением 0,017 0перекиси водорода, Затем стекла склетками отмывали 3 раза по 10 мин иподсушивали феном. На культуры клетокнаносили необходимые кроличьи антисыворотки (к вирусу простого герпеса 25или приону амиотрофического лейко.спонгиоза) в рабочем разведении 1:50и помещали во влажную камеру нае40 мин при 37 С. Затем клетки сноваотмывали, и наносили коньюгат (овечьи ЗОантикроличьи антитела меченные пероксидазой 1 в разведении 1:100, Через40 мин контакта во влажной камерепри 37 С повторяли процедуру отмывоки, и стекла с исследуемыми культурами клеток погружали в темной камере в раствор субстрата (35 мг 3,3-диаминобензидина в 50 мл физиологического раствора и 0,03% перекиси водорода) на 30 мин. Затем стекла извлекали, отмывали, проводили через серию спиртов и ксилол, и заключалив канадский бальзам. Результат учитывали под световым микроскопом,по наличию в зараженных клетках корич нево окрашенных круглых структур, приотсутствии таковых в незараженныхклетках.Для того, чтобы установить опти-.мальные условия для проникновениявозбудителей из СМЖ в клетки был проделан ряд опытов. Культура клетокнейронов обрабатывалась средой с рН6,0-6,5 в течение 30-60 мин. Это былосделано для изменения проницаемости55клеточной мембраны,П р и м е р 1. Исследовали СМЖ больной К, с подозрением на герпетический энцефалит. Заражали эмбриональную культуру клеток диссоциированных нейронов после обработки ее средой с рН 6,0 в течение 30 мин. Через 2 сут после заражения в нейронах были выявлены антигены вируса простого герпеса иммунопероксидаэным методом, Диагноз - герпетический энцефалит.П р и м е р 2. Исследование СМЖ больной Д с подозрением на амиотрофический лейкоспонгиоз, заражали культуру клеток диссоциированных нейронов после обработки их в тече-. ние 40 мин средой с рН 6,0. Через 3 сут после культивирования в клетках был обнаружен антиген возбудителя. Диагноз - амиотрофический лейкоспонгиоз.П р и м е р 3. С%К больной Г. с подозрением на амиотрофичеСкий лейкоспонгиоз заразили эмбриональную культуру клеток диссоциированнь 1 х нейронов после их предварительной обработки средой с рН 6,5 в течение 15 мин. При наблюдении и исследовании этой культуры в течение 2 недель развития вирусной инфекции не установлено.Предварительная обработка культур клеток диссоциированных нейронов приводит к повышению чувствительности метода - из 53 образцов СМЖ с подозрением на герпетическую инфекцию при использовании предлагаемого способа вирус выявлен в 23 случаях, а по способу-прототипу - в 11 случаях.формула изобретенияСпособ определения нейровирусов в спинно-моэговой жидкости, включающий культивирование вирусов в культуре клеток с последующим иммуноферментным анализом, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве культуры клеток используют первичные диссоциированные нейроны мозга эмбрионов, которые перед определением нейровирусов обрабатывают минимальной средой "Игла" с рН 6,0-6,5 в течение 30-60 мин.