Способ определения атакуемости белка пепсином

(21) (22) (46) (71) акуеетеув эо созобвоел опросы питания. ина,ы По повь ектриче биологи агропро в тночерез реа лок, в со ериехсти в пи нарии, з нологииЦель ности, ч упрощениЦель риодом по замкнутоипепсин ддение то пособа, е изобретения - и увствительности при прочи ляют пока мого белк белка), в скорени ст единицах. Способ разом. Опре ледующим обтвляют обав домо ач нализато АФ,высоко кГц; си мещеннуют на ние пров тивной а де яют воэбьггоч ивности араметр ота 880 е фермент спользуя едующиеока: часкА, В кюруемую я том частотногла тока 2 реагенть ету, по ейку пр с а,ермоста ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬПМЯМПРИ ГКНТ СССР 4314379/28-1408,10,8715.09,89, Бюл, И 34Киевский медицинский институтим. акад, А,А,Богомольца(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТАКУЕМОСТИБЕЛКА ПЕПСИНОМ(57) Изобретение относится к медицине, в частности биологии, и можетбыть использовано в агропромышленномкомплексе, а именно в пищевой промыш бретение относится к медиц и и может быть использова мьддленном комплексе, в ча щевой промышленности, ве оотехнике, а также в био достигается тем что к ра лка приготовленному на буфер- створе, поддерживающем оптидля реакции пепсин - белок е рН на уровне 2,1+0,8, д дный раствор пепсина заве ной активности по отношению к для реакции количеству белка,перемешивают и через реакцимесь пропускают слабый высокой ток постоянной силы. ленности, ветеринарии, зоотехнибиотехнологии для определения амости белка пепсином, Целью иния является повьддение точносствительности, информативностиба, его упрощение, сокращение длтельности определения. Сущностьретения состоит в том, что к рарам контрольного и испытуемогоков добавляют водный раствор пе через реакционную смесь пропускаютслабый высокочастотный ток постояннои силы и по кривым динамики повшения напряжения в цепи в опытнойконтрольной пробах судят об атакуемости белка пепсином, 1 табл. гашению напряжения в цепи ского тока, пропускаемого кционную смесь пепсин - бепоставлении с уровнем и певышения напряжения в цепи, через реакционную смесь эталонный белок (казеин) х равных условиях, опредезатель атакуемости испытуеа (относительно эталонного сражающийся в безразмерных(ь) (йс, 1;,1 к к 1 о11 о 1 кЬ 1,40атакуемость белка пепсином;относительная глубина расщепления выражаемая в безразмерных единицах, равная частному от деления величи" ны Отклонения стрелки милли вольтметра при испытании опытной пробы белка Ь, (мм) на соответствующий показа-.тель, полученный при испытании пробы эталонного бел ка Ь(мм);относительная скорость расщепления белка, выражаемая в безразмерных единицах, равная частному от деления 55 произведения величины отклонения стрелки милливольтметра при испытании опытной 3 1508167работающую в режиме +370, вносят1,А мл буферного раствора с концентрацией водородных ионов (рН), равной2,10,8, затем добавляют туда же0,6 мл рабочего раствора эталонногобелка, например казеина, вставляютдатчик с двумя электродами и подсоединяют его к прибору,Запись потенциала напряжения производят на диаграмной ленте самопишущего милливольтметра. Убедившись,что диаграмма параллельна направлениюдвижения ленть в кювету через отверстие в датчике вводят водный растворпепсина, 1 мл которого содержит 1 мгкристаллического пепсина, в количестве, большем чем требуется для расщепления данного количества белка. Записьпотенциала напряжения производят до 20прекращения его роста, Аналогично производят запись хода ферментативной реакции пепсин - испытуемый белок. Анализируя кривые, оценивают их конфигурацию, получая при этом важную информацию об интенсивности ферментативного процесса на разных его стадиях, рассчитывают относительную глубину расщепления, относительную скорость расщепления (показатели, имею- ЗОщие и важное самостоятельное значение) и атакуемость белка пепсином.Атакуемость белка .1 епсином рассп.гывается по формуле рробы белка 11 и процолжи-; тельности 1 (мин) реакции пенсии - эталонный белок напроизведение отклонения"трелки милливольтметра прииспытании коьтрольнои прОбыэталонного белка Ь(мм) ипродолжительности реакциипепсин - опытный белок 1(мин),П р и и е р 1. Приготовляют пробы эталонного белка и испытуемогобелка: 1 г мелкорастертого сухогобелка помещают в колбу и добавляютк нему 70 мл дистиллированной водызатем при помешивании туда же добавляют 10-2 мл 0,2 н, раствора едкогонатрия, а затем по каллям - 10-12 мл0,1 н, раствора соляной кислоты дорН 7.0, Полученный основной раствориспользуют для приготовления рабочегораствора путем разбавления основногораствора в .0 раз цитратным буфернььм.раствором рН которого 2,1, В качестве эталонного белка используют казеин., Испытанию подвергался белоккормовой микробного происхождения(Е 1 О 1 П),Определение атакуемости испытуемого белка пепсином проводят при помощи анализатора ферментативной активности АФ,За 2 ч цо исследования готовят рабочий раствор пепсина В Боде для его20 мг кристаллического пепсина растворилн в 20 мл дистиллированной водь 1,После включения анализатора и про 1 рева его в течение 30 мин при режиметермостата ф 370 в кювету, установ ленную В гнездо термостатв. Вносят0,6 мл рабочего раствора эталонногобелка - казеина и 1,4 мл цитратногобуферного раствора рЯ - 2,1, затем вкювету погружают датчик с двумя электродами и подключают его к прибору.Производят пробную запись потенциаланапряжения при силе тока 20 мкА.убедившись, что диаграмма параллельнанаправлению движения ленты, в кюветучерез отверстие в датчике вводят0,06 мл рабочего раствора пепсина,Запись потенциала напряжения произво"дят после перемешивания реакционнойсмеси магнитной мешалкой в течение20 с, Запись прекращают после выходадиаграммы на направление, параллельное направлению движения ленты сам5 15081 писца. Аналогично производили запись реакции пепсин - БКМП.Результаты определения и расчета атакуемости белка БКМП пепсином представлены в табл.Как видно иэ табл,1, показательатакуемости испытуемого белка БКМПпепсином по отношению к казенну составил 0,4986, что свидетельствует оневысоком уровне атакуемости белкамикробного происхождения пепсином,При этом показатель относительнойглубины расщепления составил 0,6316,а показатель относительной скоростирасщепления - 0,7895.П р и м е р .2, Способ выполняютаналогично примеру 1, однако исследованию подвергали 10 проб казеина,отобранных из одной партии.Параллельно были проведены исследования проб белка кормового микробного происхождения БКМП, отобранныхиз одной партии.Результаты определения атакуемости белка кормового микробного происхождения (БКМП) в сопоставлении сэталонным белком представлены втабл,2,Как видно из табл,2, в серии из10 параллельных определений атакуемости БКМП относительно казеина результаты с надежностью 95,4% предлагаемым способом можно получить с пог 35решностью 2,9%,При этом показатели глубины расщепления и скорости расщепления БКМПпо сравнению с казенном определяютсяс еше меньшей погрешностью (соответственно 2,25 и 2,75%), Такой уровеньпогрешности измерений характеризуетпредлагаемый способ как достаточноточный (воспроизводимый и правиль 45ный), Относительно невысоким уровнемхарактеризуются также и показателирассеяния; сигма и коэффициент вариации, составившие для относительнойскорости расщеплениями относительнои 50глубины расщепления и атакуемостиБКМП соответственно 0,0364 (4,35%),0,0238 (3,56%) и 0,0257 (4;58%).Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным имеетследующие преимущества:высокая точность (ЬЕ = 2,9%) ичувствительность (1,8 10 белка,67 бпри 6,0 - 12,0 ф 10 э г белка при использовании известного способа)регистрация хода реакции на диаграммной ленте самописца по аналоговому типу, в результате чего активность реакции пепсин " белок можно оценить в динамике времени в любой ее точке, что обеспечивает более высокую информативность способа определения атакуемости белка пепсином и позволяет рассчитать показатель атакуемости белка пепсином в сопоставлении с эталонным белком по предложенной формуле (А = ГЯ), а также обрабатывать данные при непосредственном вводе их в ЭВМ;возможность проведения определения атакуемости пепсином микроколичеств белка (около 18 мкг белка);сокращение продолжительности определения с 3-6 ч по известному способу до 8-12 мин по предлагаемому;сокращение расхода пепсина (кристаллического препарата) и субстрата в 100 - 250 раз по сравнению с известным способом, что особенно важно при изучении атакуемости белка, образцы которого имеются в малых количествах;упрощение способа, достигаемое сокращением числа этапов определения,Формула изобретенияСпособ определения атакуемости белка пепсином путем добавления к раствору испытуемого и контрольного белка водного раствора пепсина и исследования ферментативной реакции пепсин - белок, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, его упрощения и ускорения, дополнительно через реакционную смесь в течение всей реакции пропускают высокочастотный ток постоянной силы, регистрируют динамику глубины и скорости расщепления белка по повышению напряжения в цепи в опытных и контрольных пробах, а атакуемость белка пепсином рассчитывают по формуле- атакуемость белка пепсином; - относительная глубина расщепления;- относительная скорость расщепления белка,= 0,4986 Таблиц а 2 Относи- ОтносиПоказ аВРпарпроб Казеин тель атательная глубина расщепления БКМП тельная Продолжитель"ность МаксимальноеотклонеМаксимальноеотклоПродол- жительскоростьрасщепленияБКМП куемостиБКМП пепсином (показенну) ность реакции пепсин -реакциипепсин -БКМП,мин нениестрелкиН"39,мм стрелки Н, мм казеин,мин Статистические показатели,Хф шС(Ж)95,4 (Е) 0,66970,02380,007543,562,25 0,8365 0,0364 0,01 15 4 у 35 2,75 0,5599 0,0257 0,0083 1 4,58 2,90 Составитель А,СкуратРедактор М,Келемеш Техред М.Моргентал Корректор М,Самборская Заказ 5536/48 Тираж 789 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж-З 5, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина.,101 1 2 3 4 5 6 7 8 91 О О 2 4 6 8 30 12 36 38 37 37 38 37 36 38 37 38 0 16 26 ЗО 36 38 38 311210,5101101110,51110,5 10 10 10 30 10 10 10 25 24 25 25 26 25 25 24 24 26 0 10 18 20 24 24 24 9 9 8 8,5 9 8 9 7,5 8,5 9 0,6944 0,6316 0,6757 0,6757 0,6848 0,6757 0,6944 0,6316 0,6486 0,6842 0,8488 0,8421 0,8868 0,7949 0,7772 0,8446 0,8488 0,8842 0,8394 0,7982 0,5894 Оу 5319 0,5992 О 5371 0,5318 0,5707 0,5894 0,5584 0,5445 0,5462