Способ количественного определения в зерне и зерновых продуктах 4, 15-диацетокси-8-(3-метилбутирилокси)-12, 13 эпокситрихотецена-3-ол

СОЮЗ СОВЕТСНИХ.СОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 14244 4 01 И 33/48 ИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ОПИСАК АВТОРСКОМ С 8 ИДЕТЕЛЬСТВУ лтянск ельство СССР /00, 1979. УДАРСТВЕННЦЙ КОМИТЕТИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬПИЯМГКНТ СССР(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ЗЕРНЕ И ЗЕРНОВЫХ ПРОДУКТАХ4, 15-ДИАЦЕТОКСИ-(3-МЕТИЛБУТИРИЛОКСИ)-12, 13-ЭПОКСИТРИХОТЕЦЕНА-ОЛ(57) Изобретение относитсяк микробиологии, а именно к микробиологическим исследованиям токсинов. Цельюизобретения является повышение чувствительности способа определения4,15-диацетокси-(З-метилбутирилокси)-12, 13-эпокситрихотецена-ол путем сниженмя предела обнаруженияминимальных количеств микотоксина.Изобретение позволяет повысить чувст Изобретение относится к микробиологии, а именно к микробиологическим исследованиям токсинов.Цель изобретения - повышение чувствительности способа определения 4,15-диацетокси-(З-.метилбутирилокси)-12, 13-эпокситрихотецена-ол путем. снижения предела обнаружения минимальных количеств микотоксина.Способ заключается в экстракции образца, нанесении экстракта исследуемой пробы на хроматографическую пластинку, последующей ее хроматограгвительность определения 4, 15-диацетокси-(3-метилбутирилокси) - 12, 13-эпокситрихотецена-ол (микотоксина Т) микробиологическим методом, Применяют для обнаружения пятен микотоксина на хроматографической пластинке специфическую чувствительную культуру дрожжей Басс 11 агошусез 1 асСгз ВКИ, параллельно с хроматографией образца хроматографируют ряд последовательно нанесенных пятен стандартного раствора микотоксина с содержанием его О, 015-0, 1 мкг, используют для заливки хроматографических пластинок после хроматографии сусло-агар с внесенным в него стандартизирован- С ньи количеством дрожжевых клеток 0,8-1"М 10 в мл., определяют количество токсина Тв исследуемом образце по наименьшему количеству стандарта ток- Се сина и иследуемого образца, при котором на хроматограммах образуются зоны задержки роста дрожжей с ВГ образца, равным М чистого микотоксина. фии, обнаружении токсина с помощью специфической культуры дрожжей. Параллельно с хроматографией образца хроматографируют ряд последовательно нанесенных пятен стандартного раствор микотоксина с содержанием токсина в пятне О, 015 О, 02; О, 03; О, 04; О, 05;0,07; О, 1 мкг. Обе пластинки заливают агаризованной средой с внесеннь 1 м в нее стандартизированным количеством 0,8-110 в 1 мл дрожжевых клеток5штамма ЯассЬагошусез 1 асг 1.я ВКМ, инкубируют пластинки, определяют наи 3 142449 меньшее количество исследуемого образца и наименьшее количество стандартного чистого микотоксина, при котором образуется зона задержки рос 5 та дрожжей с Ы образца, равным Ы чистого микотоксина.Выбор количества чистого токсина при хроматографировании определяется чувствительностью культуры дрожжей. Выбор стандартизованного количества дрожжевых клеток в агаризованной среде 0,8-110 (1 мл среды обеспечи 6вает такую плотность засева среды, при которой образуются четкие зоны задержки роста дрожжей при низких количествах микотоксина в пятне на хроматограмме.Использование не применяемого ранее для выявления Ттоксина штам ма дрожжей БассЬагошусее 1 асге ВКМУ повышает чувствительность способа на 30-40 Ж.Способ осуществляют следующим образом.Измельченное. зерно ржи, пшеницы и других зерновых культур. или зерно- продукты экстрагируют хлороформом.Отфильтрованный экстракт упаривают до полного удаления хлороформа, оста 30 ток растворяют в определенном объеме хлороформа, наносят на хроматографические пластинки с тонким закрепленным слоем силикагеля последовательно ряд пятен образца в количест ве 1,3,5,7, 10, 12, 15 мкл и ряд пятен раствора Ттоксина в количестве 0,015 р 0,02.; 0,03 р 0,04; 0,05 р 0,07; О, 1 мкг, хроматографируют пластинкив системе бенэол-ацетон 3: 2, высушива ,ют и заливают сусло-агаром, в которй внесен на 10,мл агара 1 мл суспен зии односуточной культуры дрожжей ЯассЬагошусее 1 асгге ВКМУ, содержащей 810 клеток в мл . (10 едибниц по стандарту мутности), инкубируют пластинки во влажной камере18"20 ч при 26-28 С, определяют наименьший объем исследуемого образца и наименьшее количество чистого токси- ц на Т, вызывающие образование на хроматограмме зон задержки роста дрожжей с Вг образца, равным КГ раствора чистого микотоксина, рассчитывают количество микотоксина Т(Х) в испыту емом образце по формулеА ВХ =БГ 4 4где А - наименьшее количество микотоксина Т, которое вызывает образование эон задержкироста дрожжей на хроматограмме, мкг;Б - масса исследуемой пробы продукта, гВ - объем экстракта исследуемойпробы, мкл;Г - наименьшее количество экстракта исследуемой пробы, которое дает задержку ростадрожжей на хроматограмме, мкл.П р и м е р ,.1, 50 г измельченного зерна экстрагируют 200 мл хлороФорма. Экстракт фильтруют, выпаривают в токе воздуха до полного удаления хлороформа, остаток растворяют в.5 мл хлороформа, наносят последовательно в количествах 1,3, 5, 7, 10, 12, 15 мкл на хроматографические пластинки. В качестве вещества-свидетеля наносят на те же пластинки 2 мкл чистого раствора Ттоксина в хлороФорме 0,05 мкг/мкл. На другие хроматографические пластинки наносят последовательно пятна раствора чистого Ттоксина с количеством микотоксина в пятне 0,015; 0,02; 0,03; 0,04;0,01; 0,07; 0,1 мкг. Пластинки хроматографируют в системе бенэол-ацетон Зф 2 и высушивают, Далее проводят 4 варианта опыта для доказательства преимущества предлагаемого способа.Вариант 1. На поверхность пластинок наносят расплавленный и охлажденный до 50 С сусло-агар, в который предварительно вносят суспенэию клеток односуточной культуры дрожшей штамма БассЬагошусее 1 асгге ВКИУв стерильном физиологическом растворе в количестве 810 клеток на 10 мл агара (1 мл суспензии клеток, мутность которой соответствует 10 единицам стандарта мутности, на .10 мл сусло-агара) . Пластинки выдерживают во влажной камере при 28 С 18 ч, после чего учитывают характер роста штамма ВКИУ. Наличие зоны угнетения роста дрожжей на хроматограмме с нанесенным исследуемым образцом с центром в точке, Ы которой равен И зоны, вызванной веществом-свидетелем, указывает на наличие в образце продукта микотоксина Т.Наименьшее количество образца, при котором наблюдается образование5 14244 зоны задержки роста дрожжей на хроматограмме Г, 7 мкл. Наименьшее количество чистого токсина Т, вызывавшее образование зоны задержки роста дрожжей на хроматограмме А,5 0,02 мкг. Количество микотоксина Т(Х) в испытуемом образце зерна рассчитывают по формуле (А = 0,02 мкг), Б = 50 г, В = 5000 мкл, Г = 7 мкл)0 02 мкг 5000 мклХ - --------- 0,28 мкг/г50 г 7 мклВариант 11. На поверхность пластинок наносят расплавленный и охлажденный до 50 С сусло-агар, в кото-, рый предварительно вносят суспензию клеток односуточной культуры Штамма СапйЫа ряецйоггордса 11 я 44 пк, Нанесение культуры на хроматограмму 20 осуществляют по предлагаемому способу аналогично варианту 1 для сопоставимости чувствительности культур. Культуру вносят в стерильном физиологическом растворе в количество 25 810 клеток на 10 мл агара (1 мп суспензии клеток, мутность которой соответствует 10 единицам стандарта мутности, на 10 мп сусло-агара). Пластинки выдерживают во влажной ЗО камере при 28 С 18 ч, после чего учитывают характер роста, штамма 44 пк, как в варианте 1.Наименьшее количество образца, при котором наблюдается образование зоны задержки роста дрожжей на хро 35 матограмме Г, 12 мкл. Наименьшее количество чистого токсина Т, вызвавшее образование зоны задержки роста дрожжей на хроматограмме А, 0,03 мкг. Количество микотоксина Т(Х) в испытуемом образце зерна рассчитывают по формуле (А = 0,03 мкг, Б = 50 г, В = 5000 мкл, Г = 12 мкл) .Оа 03 мкг 5000 мкл = 0 25 гг 450 г ф 12 мкл Вариант Т 11, На поверхность пластинок наносят расплавленный и охлажденный до 50 С сусло-агар, в который 50 внесены клетки односуточной культуры дрожжей ЗассЬагошусея 1 асдя ВКМУ в количестве 0,8-1108 в 1 мл, т.е. в 10 раз меньше рекомендуемого. Пластинки выдерживают во влажной ка мере при 28 фС 18 ч, после чего учитывают характер роста штаммаВКМУ. При таком количестве дрожжевых клеток в агаре четкие зоны за 94 бдержки роста дрожжей не выявляются, культура дрожжей растет в агаре в виде отдельных точечных колоний.Вариант 1 У, Выполняют аналогично варианту 1, но вносят в сусло-агар 1 10 дрожжевых клеток в 1 мл, т.е.8в 100 раз больше рекомендуемого. Пластинки выдерживают при 28 С 18 ч, после чего учитывают характер роста штамма ВКМУ, как в варианте 1. При таком количестве дрожжевых клеток в агаре на хроматограмме с нанесенным экстрактом исследуемого образца зерна зоны задержки роста дрожжей не выявляются. Наименьшее количество чистого токсина Т, вызывавшее образование зоны задержки роста дрожжей на хроматограмме А, 0,05 мкг.Из приведенного примера видно, что предлагаемый способ определения 4, 15- диацетокси-(3-метилбутирилокси)- 12, 13-эпокситрихотецена-ол (мико- токсина Т) с использованием культуры дрожжей Басспагошусея 1 ася ВКМУпозволяет обнаружить на хроматограмме до 0,02 мкг микотоксина в пятне, тогда как применение пггамма СапйЫа ряеийоггорса 1 я 44 пк (при проведении всех остальных приемов анализа зерна аналогично предлагаемо- . му способу) позволяет обнаружить на хроматограмме до 0,03 мкг микотоксина в пятне, Таким образом, только за счет использования штамма ЯассЬагошусея 1 асгдя ВКМУна 30-40 повышается чувствительность способа определения микотоксина.Формула изобретенияСпособ количественного определения в зерне и зерновых продуктах 4,15-диацетокси-(3-метилбутирилокси) -12, 13-эпокситрихотецена-ол, предусматривающий экстракцию, нанесение экстракта исследуемой пробы на хроматографическую пластинку, последующую ее хроматографию, обнаружение микотоксина с помощью специфической культуры дрожжей, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью повьппения чувствительности способа, параллельно с хроматографией экстракта хроматографируют ряд пятен стандартного раствора микотоксина с содержанием его 0,015-0, 1 мкг в пятне, обе пластинки заливают агаризованной средой с внесенным в нее стандартизованным количеством дроикевых кле1424494 Составитель.Л. БорисоваТехред Л.Олейник Редактор Н.Федорова Корректор Т.Палий Заказ 4919 Тираж 788 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб, д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 ток 0,.8-1 10 на 1 мл штамма ЯэссЬагошусез 1 асС 1 з ВКМУ, определяют наименьшее количество стандарта микотоксина и исследуемого образца,при котором на хроматограммах образуются зоны задержки роста дрожжейс Кс образца, .равным ВХ чистого микотоксинае