Способ индентификации сероваров бактерий вида bacillus тнuringiеnsis

(19 2 11 1 р 7 бПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) Авторское свидетельство СССРВ 378412, кл, С 01 Й 33/569, 971.(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СЕРОВАРОВБАКТЕРИЙ ВИДА ВАС05 ТНОЙМ 0 ЕМ 515(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается идентификации энтомопатогенных микроорганизмов вида 8 ас 1 иэ йЬцгидепзз. Целью изобретения являетсяупрощение способа, Штамм Вас. СЬцги 9 епзз идентифицируется путем одновременного определения его чувствительности к набору фагов ВКПМ У РН,ВКПМ У РН, ВКПМ У РН, ВК 1 ЖР РН, ВКПМ У РН, ВКПМУ РН. Каждый из полученных сероваров проявляет чувствительностьтолько к своей определенной, отличнойот других группе фагов, Это позволяетс высокой точностью и достоверностьюотносить изучаемый штамм к определенному серовару. 1 табл.Изобретение относится к микробио,логической промышленности и касается энтомопатогенных микроорганизмов Вас. СЬцгп 91 епзэ. Штаммы Вас, йЬигпд 1- епэ 1 з широко используются в микробиологической промышленности в качестве продуцентов бактериальных средств с вредными насекомыми.Цель изобретения заключается в разработке нового способа идентификации штаммов Вас. йЬгпдепзэ 1, 1, 1, 1 Ч, Ч, .Х Ч серотипов, характери,зующегося меньшей трудоемкостью за счет снижения затрат времени и труда 15 и позволяющего идентифицировать вариантысеротипа.Поставленная цель достигается тем, что штамм Вас. йЬог 1 п 91 епэ 1 з идентиФицируется путем одновременного опре еления его чувствительности к набору фагов: Тд 13, Т 918, Т 925, Тр 115, 921, Тд 15. Установлено, что каждый из.из"енных серотипов Вас. 1 Ьцгп 91 еп 1 э проявляет чувствительность только к 25воей определенной, отличной от дру-гих группе фагов, что позволяет с вы окой точностью и достоверностью отноить изучаемыйштамм к определенному ,серотипу (см. таблицу)ЗОИэ данных таблицы видно, что 1 серотип чаг. 1 пзесйцз чувствителен только к фагу Т 925, а к фагам Т 913, Т 918, д 15, 921, Тр 115 не чувствителен;серотип, чаг. ййцг 1 пд 1 епзз чувстителен к фагам Т 925, Тс 15, Тр 115не чувствителен к фагам Тд 13, Т 918, 21; 1 серотип, чаг. Г 1 п 11 пвэ чувтвителен к фагам Тс 15, 921, Тр 115не чувствителен к Фагам Т 913, Т 918,925; 1 серотип, чаг. 1 игз 1 а 11 чувствителен к фагам Т 913, Тд 25, Т 918, Тр 115 и не чувстви "елен к Тс 15, 921; Ч серотип, чаг. депдго 1 вцз чувствителен к фагам Т 615, Тр 15 и не чувствителен к Т 913, Т 925, Ту 18, 921; Ч серотип, чаг. да 1 егае чувствителен ко всем исйользованным фагам; ХЧ сеотип, чаг. 1 эгае 1 епзэ чувствителен 1 фагу 921 и не чувствителен к Т 913,50 Г 925, Т 918, Тд 15, Тр 115.Таким образом каждый серотип чувствителен только к определенному фагу ли к определенной группе фагов, т.е. немеет свой спектр чувствительности к предложенной группе Фагов. Определив, к каким фагам из предложенной группы Чувствительна проверяемая культура,по таблице можно определить ее серотип.Получение и характеристика фагов, необходимых для определения серотиповштаммов Вас. йЬпг 1 п 91 епзз. Фаги Т 913, Т 925, Т 918, Тд 15 получены в лабораторных условиях путемвыделения из почвы методом обогаще"ния Фаги 921, Тр 115 выделены из промьппленных фаголизатов при производстве знтобактерина. По классификацииТихоненко перечисленные фаги относятся к следующим группам: фаги Т 913, Тд 5, Тд 25 и Тр 115 относятся к 1 группе фагов с сокращающимся чехлом отростка; фаг Т 918 - кгруппе, которая характеризуется удлиненным капсидом и структурой типа "воротника"э расположенного между капсидом и коротким отростком; фаг у 21 - кгруппе; фаги, относящиеся к этой группе, характеризуются головкой иксагональной формы и несокращающимся отростком, заканчивающимся кисточкообразными выростами.При титровании на штаммах Вас. йЬцг 1 пдепзз чаг. да 1 1 ег 1 ае негативные колонии этих фагов имеют следующую морфологию: фаг Т 918 - колонии средних размеров (д = 3-4 мм), центр прозрачный, вокруг полупрозрачная "оборка"; фаг 921 - мелкие, прозрачные колонии; фаг Ту 13 - мелкие точечные прозрачные колонии; фаг Т 415 колонии диаметром 1,5-4 мм, очень прозрачные с резко очерченными краями; Фаг Тд 25 - колонии средних размеров (с. до 3 мм), центр прозрачный с двумя полупрозрачными "оборками" вокруг; Фаг Тр 115 - очень мелкие (д до 1 мм), прозрачные колонии.Все фаги, необходимые для данной работы, хранятся в бульоне Хоттингера. Титр используемого фага не менее 10 Фаговых частиц/мп. Препараты фагов получают методом сливного лизиса с последующим центрифугированием и фильтрованием. Весь набор препаратов фагов может быть получен в течение 3-5 дней. При хранении фагов в холодильнике (4 С) или при комнатной температуре титр фагов остается неизменным в течении 5-6 мес.Фаги Тд 3, Тд 18, Т 925, Тд 15, Тр 115 921 депонированы во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеют соответственно регистрационные номера; ВКПИ РН, ВКПМ РН,1399341 51 О 15 20 25 30 35 40 45 50 ВКПИ РН, ВКПИ РН, ВКПИРН, ВКПИ РН,Способ иллюстрируется следующимипримерами.П р и м е р 1. Определяют серотип культуры Вас 111 цз 1 Ьог 1 пдепээ.Культуру Вас. Сапогпд 1 епээ, серотип которой необходимо определить,выращивают в бульоне Хоттингера в теочение 3-4 ч при 37 С при равномерномпокачивании 220 об/мин). Для определения серотипа испытуемой культурынеобходимо иметь 6 фагов: Т 913, Т 925,Т 918, ТО 5, Тр 115, д 21 с исходным.титром 10 фаговых частиц/мл, раэмноенных на штамме Вас. сЬцг 1 пд 1 епз 1 зсеротипа.Испытуемую культуру Вас. йЬцги 91 епээ в объеме 0,3 мп добавляют до3 мп солевой среды следующего состава, г: СаС 6 Н О 0,11; МдС 1 6 Н О0,14; Мп 04 5 НдО 0,15; М 950 1,2;агар Оасс 6, бульон Хоттингера200 мл, дистиллированная вода 800 мл,рН 7,2-7,4, и выливают на чашку Петри со слоем 27. агара Хоттингера. Затем чашку Петри с испытуемым газономкультуры делят на 6 зон, в каждую изкоторых петлей наносят по одной капле каждого иэ вышеупомянутых шестифагов. Затем чашку Петри ставят втермостат на 28 С. Через 19 ч по общей картине наличия или отсутствиялизиса культуры во всех шести зонахсудят о фагочувствительности испытуемой культуры. Контролем служит штаммЧ серотипа, на котором все шесть фагов дают отчетливую зону лизиса.Лизис испытуемой культуры наблюдается только в зоне фага Т 925. Сравнивая результаты опыта с таблицей,делают вывод, что испытуемая культура относится ксеротипу, чаг. изесйцз.П р и м е р 2. Определяют серотип культуры Вас. йИцг 1 пд 1 епз 1 з.Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Ливис испытуемой культуры наблюдается в зоне фаговТ 925, Тс 15 и Тр 115.Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемаякультура относится к 1 серотипу.П р и м е р 3. Определяют серотипкультуры Вас. С 1 цгпдепзз.Все операции осуществляют в соот-.ветствии с примером 1, Лизис испытуемой культуры наблюдается в зоне фагов Тс 15, 921, Тр 115. Сравнивая рсэультаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к серотипу 11.П р и м е р 4, Определяют серотип культуры Вас. 16 цг 1 пд 1 епэ 1 э.Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуемой культуры наблюдается в зоне фагов Тд 13, Т 925, Т 918, Тр 115. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к 11 серотипу.П р и м е р 5. Определяют серотип культуры Вас, Ьцг 1 п 91 епээ.Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуемой культуры наб.юдается в зоне фагов Тд 15 и Тр 115. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод,что испытуемая культура относится к 1 Ч серотипу.П р и м е р 6. Определяют серотип культуры Вас. Сапогпдепв 1 з,Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуемой культуры наблюдается в зоне всех 6 фагов. Сравнивая результаты с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к Ч серотипу.П р и м е р 7. Определяют серотип культуры Вас. Ьцг 1 пдепээ,Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лиэис испытуемой культуры наблюдается в зоне фага 921. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к Х 1 Ч серотипу.Предлагаемый способ идентификации штаммов. 1, 11, 111, .1 Ч, Ч, Х 1 Ч серо- типов Вас. СИцг 1 пд 1 епээ с помощью набора фагов менее трудоемок по сравнению с известным способом, .основанном на применении типовых специфических иммунных сывороток. Для осуществления предлагаемого способа требуется 3-5 дней - столько времени занимает размножение данного набора фагов. Зто примерно в 1 О раз меньше времени, необходимого для получения иммунных сывороток, процесс получения которых длится 2-3 мес и требует многократной иммунизации животных. Предлагаемый способ не требует наличия животных, 55обеспечивает стандартность и достоверность получаемых результатов и позволяет.дифференцировать варианты 1с 1 цг 1 пдепэз и 1 пэесйоэ внутри 1 серотипа, что невозможно при использо"Определение серотипов штаммов Вас 11 цэ Ьцгпдепзэ по спектручувствительности к набору фагов Тд 13, Тд 18, Тд 25,. Т 015, Тр 15,д 21 Тд 3 Тд 25 Тд 18 Т 15 д 21 Тр 1 Серотипы 5те ет ет етет теее еет ете ее те,1 серотип (чаг. пэесйцз) 1. серотип (чаг. ЙЬцгпдепз 1 з) 11 серотип (чаг Г 1 пй 1 вцэ) 111 серотип (чаг. 1 сцгэйаК)1 Ч серотип (чаг. депс 1 го 11 вцз)Ч серотип (чаг. да 11 ег 1 ае)Х 1 Ч серотип (чаг, 1 эгае 1 епэз) П р и м е ч а н и е "+" Наличие зоны лизиса на газоне испытуемойкультуры."-" Отсутствие .зоны лизиса на газоне испытуемойкультуры,Составитель В. РомановаРедактор Н. Киштулинец Техред М,дидык Корректор, О.Кравцова Заказ. 2643/29 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., де 4(5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 5 1399341 6 ванин способа на основе иммунных сы- к серовару с 1 епдго 1 щцэ - к фагам воротокВКПМ У РН"663, ВКПМ В РН, к серо"вару Юцгпдепэ 1 э - к фагам ВКПМ формул а из обре т ения УРН, ВКПМУРН,ВКПМВРН,Способ идентификации сероваров " сероварубактерий вида Вас 11 цэ йЬцгпдепз, У РН, к серовару 11 пс 1 ецэ - к о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с фагам ВКПМ В РН, ВКПМ У РНу , целью упрощения способа, на исследуе- ВКПМ Ф РН, к серовару 1 цгэ мую культуру воздействуют бактерио аМ - к фагам ВКПМ у РН, фагамн ВКПМ У РН, ВКПМ У РН, ВКПМ В РН, ВКПМ:У РНВКПМ ВКПМ 9 РН, ВКПМ В РН, ВКПМ 1 РН, к серовару да 11 егае - к У РН, ВКПМ У РН, при этом к фагам ВКПМ У РН, ВКПМ В РН, серовару 1 пэесФцэ относят культуры, ВКПМ У РН, ВКПМ У РН, ВКПМ чувствительные к фагу ВКПМ У РН, 15 В РН, ВКПМ У РН.