Способ диагностики нарушения липидного обмена

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХРЕСПУБЛИН 19) (И) В 5/00 С 01033 51 ПИСАНИЕ ИЭОБРЕТВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ю,я АМН СССР .В.Василье гожева Тутельян ман Э.Ф. Т 56-59. СТИКИ НАРу ар НИЯ б л х я к медици еделения а в клинибретения -итс опр ь овышени ч- бу я этого пфугируютм натрияоторой по с этиА л Отделяют плазму, и центрифугирования с тромбоциты. Выделен осаждают центрифугир вают, гомогенизирую харозы и ЭДТА, Гомо две части, к одной яют ., лецитин а цил - 1 -фенилаланин-,ъз иколом выделяюе тромбоцитыванием, промыв растворе сат делят на оторых добав ругой - глитиламид. Обен з л ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(54) СПОСОБ ЛИАГНОДИПИДНОГО ОБМЕНА(57) Изобретение отнне, предназначено длнарушения лплидногоческой практике, Целупрощение способа иности диагностики. Лкрови пациента центрлендиаминтетраацетат разцы инкубируют в течение 30 мин, при 37 С и радиометрически на сцинцилляционном счетчике определяют активность продуктов гидролиза фосфолипазы А, а продукт гидролиза катепсина С - свободный р-нафтиламин определяют спектрофлюориметрически при волне возбуждении 366 нм и волне испускания 414 нм. Активность фосфолипазы Аопределяют по формуле А 1, =(С Р) С .100 -0,5 С, где С - концентрация субстрата; Р - Е гицролиэа, С - время инкубации; С - концентрация елка. Активность катепсина С опредеяют по формуле А= (Р С) : (Рх0,1 С где Г - интенсивность флюо- с ресценции анализируемого гомогената тромбоцитов;- время инкубации, Р з - интенсивность флюоресценции стандартного раствора Д-нафтиламина; С С- концентрация белка. Активность ферментов выражают, в наномолях субстрата, гидролизованного за 1 мин 1 мг белка. Количество фосфолипазы А, в норме 0,57 + 0,07 нмоль/мин/мг белка, катепсина С - 1,68 + 0,27 нмоль/мин/ /мг белка. При увеличении этих значений выше 2,5 и 1,2 нмоль/мин/мг белка диагностируют нарушение липидного обмена. 1 табл.РхС Ас 1 х т х 01 х С где Р 50 55 Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической практике для определения нарушения липидного обмена.Цель изобретения - упрощение способа и повышение точности диагностики эа счет использования в качестве биологического материала тромбоцитов крови и определения активности катепсина С и фосфолипазы А, .10Способ осуществляется следующим образом.У больного отбирают кровь, центрифугируют ее с зтилендиаминтетраацетатом натрия (ЭДТА). Отделяют плазму, 15 из которой после центрифугирования с фиколом выделяют тромбоциты. Выделенные тромбоциты осаждают цинтрифугированием, промывают, гомогениэируют в растворе сахароэы и ЭЛТА, Гомогенат 20 делят на две части, к одной иэ которых добавляют ф С - лецитин, а к друго й - гл ицил-Е-фе н ил ап ан ин- р-н афтиламид, Образцы инкубируют в течение 30 мин при 37 С и радиометрически на сцинцилляционном счетчике определяют активность продуктов гидролиэа фосфолипазы А , а продукт гидролиэа катепсина С - свободный р -нафтиламин определяют спектрофлюориметрически при 30 волне возбуждения 336 нм и волне испускания 414 нм. Активность фосфолипазы Л, определяют по формуле С Рсх 100 Х 05 хсрконцентрация субстрата;процент гидролиэа;время инкубации;концентрация белка,Активность катепсина С определяютпо формуле45 интенсивность флюорвсценциианализируемого гомогенататромбоцитов;время инкубации;интенсивность флюоресценциистандартного раствора -нафтиламина,концентрация стандартногораствора- нафтиламина ("Веапа 1", Венгрия),концентрация белка. Активность ферментов выражают внаномолях субстрата, гидролизованногозамин 1 мг белка,Получают количество фосфолипазыА, в норме равное 0,570,07, а катепсина С 1,68 + 0,27 нмоль/мин/мгбелка.При увеличении этих значений длякатепсина С и фосфолипазы А выше2,5 и 1,2 нмоль/мин/мг белка диагностируют нарушение липидного обмена.П р и м е р 1, У пациента В.,27 лет, с нормальной массой тела, безклинических признаков ишемической болезни сердца (ИБС) отбирали 10 млкрови в пробирку, содержащую 1,0 млЭДТА, и центрифугировали 20 мин нацентрифуге при 150я. После центрифугирования отбирали надосадочнуюжидкость и наслаивали на 6%-ный раствор фиколла с 76% верографином, центрифугировали 20 мин при 300 х 8, отбирапи мутную полоску, содержащуютромбоциты, центрифугировали 30 минпри 1200 х д. Белый осадок тромбоцитов промывалив 3,0 мл 0,15 М трисНС 1 буфере (рН 7,4) и центрифугировали 10 мин при 1200 х я, Полученныйосадок гомогенизировали, используя вкачестве суспендирующей среды 0,25 Мраствор сахароэы с 0,001 М ЭДТА.0,1 мл гомогената тромбоцитов инкубировали 30 мин при 37 С с 0,1 млсубстратно-буферного раствора (5 мМгли-фен-И А, 2 мМ дитиотрентола,4 мМ ЭДТА и 0,2% тритона Хв0,2 М растворе ацетатного буфера,рН 5,0), вносили 1,8 мл глицил-ИаОНбуфера, рН 10,4. Интенсивность флюоресценции определяли при волне возбуждения 336 нм и волне испускания414 нм.Активность катепсина С А =1,46 нмоль/мин/мг белка.0,5 мл гомогената тромбоцитов ин,кубировали 30 мин при 37 С с150 нмоль ф С в лецити, 160 мкмольацетатного буфера, рН 4,5, Продуктыгидролиэа разделяли с помощью тонкослойной хроматографии и измеряли ихактивность на сцинтилляционном счетчике, рассчитывали процент гидролиэализолицитина,Активность фосфолипазы А, А=0,59 нмоль/мин/мг белка.Всего в контрольной группе былообследовано 8 человек. Среднестатистические цифры активности по группесоставляли для катепсина С 1,68 ++ 0,07 нмоль/мин/мг белка.П р и м е р 2. У больного Р.,34 лет, с ожирением 11 степени активность лизосомальных гидролаз в тромбоцитах определяли аналогично примеру 1.Активность катепсина С А к = 3,20,а активность фосфолипазы А А =- 2,13 нмоль/мин/мг белка. 10Всего было обследовано в этойгруппе 8 больных с ожирением. Средне,статистические цифры активности погруппе составляли для катепсина С3,68 + 0,53, для фосфолипаэы А, 2,26+151 0,24 нмоль/мин/мг белка.П р и м е р 3. У больного К.,43 лет, с ИБС активность лиэосомальных гидролаз в тромбоцитах определяли,аналогично примеру 1. 20Активность катепсина С А = 7,88,а активность фосфолипаэы А Аф1, 99 нмоль/мин/мг белка.Всего в этой группе было обследовано 36 больных ИБС с нормальной массой тела и ожирением. Среднестатистические цифры активности по группесоставляли для катепсина с 7,41 +1,45, для фосфолипазы А 1,78А 0,34 нмоль/мин/мг белка. 30П р и м е р 4. У больного Д44 лет, с ИБС и ожирением 1 степениактивность лизосомальных гидролаз втромбоцитах определяли аналогичнопримеру 1, до и после проведения курса диетотерапии.Активность катепсина С до леченияАк = 7,90, после лечения Ап =3,91 нмоль/мин/мг бедка.Активность фосфолипазы А до ле1чения А ф = 1, 92, после лечения А , =1,01 нмоль/мин/мг белка.Всего в этой грулпе было обследовано 30 больных с ИБС и ожирением.Среднестатистические цифры активности 45по группе для катепсина С до лечения7,69 Т 1,02, после лечения 3,87 ++ 0,14 нмоль/мин/мг белка (р с 0,01). 4Сводные данные по активности лизосомальных гидролаз в тромбоцитах 1 О пациентов представлены в таблице. Как видно иэ приведенных примеров, величина нормальных значений активности катепсина С и фосфолипазы А в контрольной группе обследованньп: соответствовала 1,68 + 0,27 и 0,57 + + 0,07 нмоль/мин/мг белка. У больных с нарушеным липидным обменом с клинической картиной ИБС и ожирением (и = 44) в тромбоцитах наблюдалось увеличение активности лиэосомальных катепсина С до 6,73 .й 1,49 (р с 0,001) и фосфолипазы А до 1,87 + + 0,41 (р0,01) нмоль/мин/мг белка. Под влиянием лечения у больных ИБС и ожирением в тромбоцитах активность катепсина С снижалась с 7,691,02 до 3,87 1 0,59 (р с 0,01), а фосфолипазы А, с 2, 13 + 0,25 до 1,09 + О, 14 (р с 0,01) нмоль/мин/мг белка, приближаясь к нормальным значениям. Курс диетотерапии проводили у 30 больных с нарушенным липидным обменом, у 9 из них активность лизосомальных гидролаз в тромбоцитах после лечения вернулась к норме. Предлагаемый способ может служитьконтролем эффективности диеты прикоррекции метаболических нарушений убольных ИБС и ожирением. формула изобретения Способ, диагностики нарушения липидного обмена путем отбора биологического материала и определения в ней лизосомальных гидролаз, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повьппения точности диагностики, в качестве биологического материала используют тромбоциты крови, определяют в них активность лиэосомальных катепсина С и фосфолипазы А и при значениях активности вьппе 2,5 и 1,2 нмоль/мин/мг белка соответственно диагносцируют нарушение липидного обмена.1324637 Активность, нмоль/мин/мг белка Пациент фосфолилазы АНет нарушениялипидного обмена 0,66 2,13+ ,Диагностика зат- руднена 0,89 2,31 То же 1,18 2,37 1,25 1,42 2,87 То же 2,98 1,50 3,23 1,92 2,62 3,85 3,64 4,15 4,66 3,68 10 Составитель Н.ГуляеваТехред Л.Сердюкова Корректор М.Пожо Редактор О.Головач Заказ 2986/2 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Степеньвыр аженности изменений Тираж 595 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Оценка изменений активности фер- ментов Диагносцируетсянарушение липидного обмена