Способ определения бактерицидной активности сыворотки крови

,80112096 1 В 10/О ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯМ 40 ева, В. Г Князева ецов Д дарственныи медицин М. Горького В., Кузьмина Т. А, рицидной активности етодом нефелометрии. - 11 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Донецкий госуский институт им. А.(56) 1. Смирнова ООпределение бактесыворотки крови мЖМЭИ, 1966,4, 8(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ, включающий инкубацию разведенной сыворотки с тест-культурой микробных клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени исследования, инкубацию тест- культуры микроорганизмов проводят одновременно с цельной сывороткой и определяют бактерицидную активность по отношению количества радиоактивного нуклеозида, поглощенного микроорганизмами в разведенной сыворотке, к количеству радиоактивного нуклеозида, поглощенного микроорганизмами в цельной сыворотке,1120968 2тимидина - Н в объеме 0,1 мл среды 199.зВ 1 - 5 пробирки вносят по 5 Х 10 микробных клеток суточной культуры Мо 209 в объеме 0,2 мл физиологического раствора. В б-ю пробирку, которая служит контролем спонтанного связывания метки, микробную взвесь не добавляют. В нее приливают 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Все манипуляции производят с использованием скоростных полуавтоматических пипеток. Затем смесь в пробирках встряхивают, перекрывают над пламенем горелки в стерильном боксе пробками и помещают на 2 ч в термостат при 37 С. После инкубации бактерии осаждают на фильтре 1 Сынпор или Миллипор и под вакуумомотмывают от невключившейся метки 10 мл физиологического раствора и фиксируют 5 мл метанола. Фильтры помещают во флаконы для счета, заливают 20 мл сцинтилляционной жидкости и подвергают радио О метрии. Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной технике, и может быть использовано в качестве об ьективного теста для характеристики естественной иммунологической реактивности организма.Известен способ определения бактерицидной активности сыворотки крови, включающий инкубацию разведенной сыворотки с тест-культурой микробных клеток, Определение бактерицидной активности сыворотки осуществляют методом нефелометрии до и после инкубирования смеси 1,Однако этот способ недостаточно точен, .поскольку проведение исследования бактерицидности осуществляется не в цельной (100%) сыворотке, а в ее относительно низкой (18%) концентрации, без учета того, что рост микробов в системе жидкая среда- сыворотка крови зависит от конкретных взаимоотношений трофических и бактерицидных факторов. При слабой концентрации сыворотки вследствие преобладания трофического эффекта, возникает ситуация, когда могут нивелироваться индивидуальные различия в бактерицидной силе испытуемых сывороток, Кроме того, регистрируются только простые количественные изменения оптической плотности микробной взвеси. При этом учитывая серийность исследования, время, затраченное на настройку прибора, на манипуляции измерения оптической плотности и расчет показателей, результат может быть получен не ранее, чем через 4 - 5Цель изобретения - повышение точности и сокращение времени исследования.Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения бактерицидной активности сыворотки крови, включающему инкубацию разведенной сыворотки с тест-культурой микробных клеток, инкубацию тест-культуры микроорганизмов проводят одновременно с цельной сывороткой и определяют бактериальную активность по отношению количества радиоактивного нуклеозида, поглощенного микроорганизмами в разведенной сыворотке, к количеству радиоактивного нуклеозида, поглощенного в цельной сыворотке.Способ осуществляется следующим образом. Для каждой испытуемой сь 1 воротки используют 6 пробирок. В 1-ю пробирку наливают 1 мл цельной сыворотки, а и остальные, кроме 5-й и б-й пробирки, по 1 мл разбавленной среды 199 стандартная среда 199 на растворе Хенкса, рЫ = 7,21 сыворотки в нисходящих концентрациях50,0/ 25,0 - 12,5 О/о. Кратность разведения оставляет соответственно 2, 4, 8 раз. В 5-ю пробирку и 6-ю пипетируют по 1 мл среды 199. Во все пробирки вносят по 2 мк КИ 25 ЗО с 5 з дг 5 О 1 Рассчитывают бактерицидную активность по формуле А = Б ХК где А - бактерицидная активность; Б - радиоактивность микробной массы, ипкубированной при концентрации сыворотки, не вызывающей торможения захвата метки; С - радиоактивность микробов, инкублрсванных в цельной сьгворотке; Ккратносгь разведения сыворотки.Пример. Исслсдование сыворотки больного К. В 1-го пробирку наливают 1 мл цельной сывороткиа в остальные, кроме 5-й и б-й пробирки., вносят по 1 мл разбавленной средой 199, сыьоротки в нисходящих концентрациях -- 50,0 О/о, 25.,0 О/о и 12,5/о. Кратность разведения сосгавляет соответственно 2, 4, 8 раз. В 5-ю и б-ю .тообирки вносят по 2 мк КИ тимидина И в обьеме 0,1 мл среды 199. В 1 - 5 пробирки вносят по 5 Х 10" микробчь х клеток суточной культуры. В. Яарйу 1 осос л 6209 в объеме 0,2 мл физиологического раствора. В 6-ю пробирку, которая служит контролем спонтанного связывания метки, микробную взвесь не добавляют. В нее приливают по 0,2 мл стерильного физиологиче" кого раствора, все манипуляции производят с ис пол ьзованисм скоростных полуавтоматических плпеток. Затем смесь в пробирках встряхивают, перекрывают над пламенем горелки в стерильном боксе пробками и помещают на 2 ч в термостат при 37 С. После инкубацли бактерии осаждают на фильтре Сынпор или Яиллипор и под вакуумом отмывают от невключившейся метки 10 ь.л физиологического раствора и фиксируют в 5 мл метанола. Фильтр помегцают во флаконы для счета, заливают 20 мл сцинтилляцонной жидкости и подвергают радиометрли. 1"гримср расчета индекса бактерицидности: при исследованиив жидком сцинтилляторе радиоактивность микробной массы, инкубированной в порции цельной испытуемой сыворотки, составляет 29740 расп. мин., а максимальная активность (158413 расп. мин.) зарегистрирована при инкубации микробов в смеси, содержащей 25 О/о сыворотки (кратность разведения - 4). При этом активность безмикробной среды 199 равняется 2415 расп. мин. В таком случае индекс бактерицидности равен 158413 - 2415 х 4 я 2 11 Х 4 = 228а 9 Чо - г 4151 Преимущество предлагаемого способа состоит в следующем. Захват тимидина - Нз микроорганизмами, отражающий синтез ДНК, является наиболее адекватным показателем их жизнеспособности, Для разведения сыворотки используют стандартную жидкую питательную среду 199. При такой постановке опыта радиоактивность микробной массы, измеряемая в жидком сцинтиляторе, всегда ниже в цельной сыворотке (максимум концентрации бактерицидных агентов) и возрастает по мере разведения сыворотки (снижение концентрации бактерицидных веществ) . Степень угнетения цельной сывороткой включения тимидина - Н в микроорганизме является в предлазгаемом способе мерой ее бактерицидности. Для ее количественной оценки используют то методическое обстоятельство, что при определенной низкой концентрации сыворотки в инкубационной среде создают наилучшие условия для жизнедеятельности микроорганизмов, что находит отражение в максимальном захвате метки. Такая индивидуальная модель инкубационной среды, лишенной бактерицидных свойств, позволяет использовать ее за точку отсчета для количественного определения степени угне тения цельной сывороткой синтеза ДНК вмикроорганизмах.Радиоактивность микробной массы, инкубированной только в среде 199 без добавления сыворотки, никогда не достигает максимальных значений. Показатель бактерицидной активности сыворотки (индекс бактерицидности) вычисляется путем де ления величины максимальной радиоактивности микробной массы на минимальную в ряду концентраций сыворотки и умножается на кратность ее разведения. Сравнительные показатели оценки бактерицидной активности 6-ти испытуемых сывороток крови представлены в таблице.Исследования включения тимидина - Нв микроорганизмы и изменений оптической плотности микробной взвеси обнаруживают 20 подавление цельной сывороткой метаболизма и роста микроорганизмов, а также полное совпадение концентраций сыворотки не оказывающей бактерицидного действия в каждом индивидуальном случае. Расчетный показатель бактерицидной активности сыворотки в предлагаемом способе выше в среднем в 1,39 раза по сравнению с прототипом. Учитывая, что разброс по радио- метрическому методу составляет 0,3% а по способу-прототипу 60 О/о, можно сделать 30 вывод, что радиометрический способ определения бактерицидной активности сыворотки крови в 200 раз точнее.Таким образом, предлагаемый способпозволяет повысить точность определения бактерицидной активности сыворотки крови З и сократить время исследования на 2 ч.1120968 о со и о со сч 4 м) щ со с 4л л лл л сс сц со и счл - сл лс в со мл с сч с м л л т сч л с д сц С 4 -щс д с ц сЦ и Крюков еонтю омитетаоткрыти кая наб.,едактор И. Касардааказ 7602/3 ВНИИПИ Госпо делам113035, Москва илнал ППП Пат Составитель ГТехред И. ВереТираж 687дарственногоизобретенийЖ - 35, Раушнт, г. Ужгор Корректор одписное ССР д. 4/5оектная,