Способ получения алкалоидов спорыньи

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК аю св А 1 К 35(511 С 12 Р 1 0 ОБРЕТ КСАН ьСй с нительн вых пр ции пров аэробсреде,и и ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫ(71) Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр РТ(54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕБИ АЛКАЛОИДОВ СПОРЫНЬИ путем ферментадуцента С 1 ансерз рцгрцгеаных условиях на питательной содержащеи источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью направленного биосинтеза алкалоидов типа эргокорнина и повышения содержания ф-эргокриптина, в качестве продуцента используют штамм С 1 ач 1 серз рцгрцгеа ММС 00186, а ферментацию ведут при 20-26 С и рН 5,2"5,8. особ по и. 1, о т л и ч а юя тем, что, с целью допол. - го повышения вьмода целе - дуктов, ферментацию ведут ствии 0,2 г/100 мл валина г/100 мп валина и изолейсоотношении последних 5:1.Изобретение относится к медицинев частности к способам полученияалкалоидав спорыньи,Известен способ получения алкалаидав спорыньи путем ферментациипродуцента С 1 ач 1 серя рогрцгеа в аэробных условиях на питательной среде,содержащей источники углерода и аза"та, минеральные соли, с последующимвыделением целевого продукта Г 1 3.Однако известный способ не обеспечивает получения повышенного содержания 8 -эргокриптина в алкалаидной смеси,Белью изобретения является направленный биосинтез алкалоидов типаэргокорнина и повышение содержания/3 -эргокриптина.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу получения алкалоидов спорыньи путем ферментациипрадуцента С 1 ач 1 серя рцгршеа ваэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода иазота, минеральные соли, с последую.щим выделением целевого продукта, вкачестве продуцента используют штаммС 1 ачсеря рцгрпгеа МЫС 00186, аферментацию ведут при 20-26 аС и рН5,2-5,8.ЗОФерментацию ведут в присутствии0,2 г/100 мл валина или 0,12 г/100 млвалина и изолейцина при соотношениипоследных 5:1Для осуществления способа используют новый штамм С 1 ач.серя ригригеа35ИМС 00186, который получен путеммногократного повторения операциивыделения и обогащения. Штамм хранится в национальной коллекции куль4 Отур микроорганизмов ММС под номером00186 и характеризуется следующимикультурально-морфологическими иФизиолого-биохимическими свойствамиКультурально-морфологические45признаки.На применяемой для отбора агаровай среде, содержащей крахмал иФриптофан, через 10 дней наблюдаются четко разграниченные колонииса складчатой поверхностью и оранжево"5 Срозовой окраской диаметром 6-8 мм,Через 20 дней диаметр колоний составляет 20-25 мм, колонии имеют в сере"дине возвышение и радиальную складчатость, цвет - розово-лиловый. Нижняя сторона колоний темна"коричневая,питательная среда вокруг них окрашивается в лиловый цвет,На солодовом агаре через 1 О днейштамм образует светло-бежевые когонии диаметром 1-2 мм и правильнойполусферической формы. Через 20 днейколонии имеют диаметр 2-4 мм, ростслабый, окраска изменяется до коричневой.На БГ-агаре колонии штамма через10 дней четко разграничены, в направлении к середине изборожденыскладками, в середине имеют остроконечное возвышениециаметр колоний8-12 мм, Вершина имеет высоту 3-5 мф.,Окраска колоний бежевая до светлокоричневой. Через 20 дней поверхность колоний твердее и по направлению к краям изборождена развеФ нляющимися складками, вершина становитсякратерообразной, Колонии имеют св- -ло-коричневую окраску с оттенкомкакао, диаметр различный 25-40 мм),высота 6-8 мм, Колонии с трудом отделяются от поверхности агара, не образуют спор.Микроскопическая характеристикаа мма в жид к ой к ул ьт ур е .После 40 ч культивирования в питательной саеде СК имеются колонии изнемногих клеток %ли большей частью отдельные клетки, Величина клеток 48 х 8-20 р., клетки плиндрические,округленные или неправильной Формы.Деление на конце клеток и путембокового ветвления. Ряды клеток короткие, состоят из нескольких клеток.Под Фазовоконтрастным микроскопомклетки оказываются сильно гранулированными, более старые клетки содержатвакулы. Спорообразования нет.В Б-питательной среде после 40 чкультивирования наблюдается идентичная картина, при этом на питательнойсреде имеется более частое образование колоний или рядов клеток. Отдельные клетки более крупные, более старые клетки не имеют вакуолей.Физиолого-биохимические свойства,Разрушает с помощью Фермента 3 -Фруктофуранозидазы сахарозу с получением промежуточных олигосахаридов,хороша использует лимонную кислоту,образует пигмент антрахиннового характера, состоящий в первую очередьиз оксиантрахинонов,При культивировании на питательной среде, содержащей сахар и амманиевую соль органической кислоты,штамм продуцирует алкалоиды, 25-302образующейся смеси алкалоидов пред -111960 40 0,2 з0,251,01,0 ставляет собой 8 -эргокриптин, основное количество (55-607) - эргокорнин, оставшаяся часть - -эргокриптин. Кроме характерных пептидньгх алкалоидов, штамм образует только эргометрин,П р и м е р 1 , Выращенную на Б-агар-питательной среде культуру С 1 ач 1 серз рцгрцгеа ИМСинокулируют на 100 мл питательной среды СК, находящейся в колбе Эрленмейера 10 (500 мл) и инкубируют при 24 С на встряхивающем аппарате (300 встряхиваний в 1 мин) в течение 4 дней. Полученную культуру по 10 мл повторно инокулируют в воськ других колбах, содержащих по 100 мл Бй-питательной среды. Эти культуры Ферментируют при о24 С на встряхивающем аппарате в течение 7 дней. В 4 колбы не прибавляют исходное вещество, к содержимому других 4 колб в начале ферментации прибавляют по 2 г валина в качестве исходного вещества. На 7 день Ферментацию прекращают. Культуральные жидкости без исходного вещества объединяют, определяют содержание алкалоидов в них. Содержание эргскорнина состав;,ет 80 /мп, с-эргокриптина - 15/мп и р -эргокриптина 30 у/мл.30Приготовленные вместе с исходным веществом культуральные жидкости также объединяют и определяют содержание алкалоидов. Эти жидкости содержат./мл эргокорнин 250, сХ -эргокриптин 25 и /э -эргокриптин 30.35Применяемые питательные среды.Питательная среда:Трипказин, г 7,0Лимонная кислота, г 4,0Кислый форсфорнокислый калий (первичный), гСульфат магния, гГидроокись аммонияВода, мл В колбы наливают но 84 или 840 млпитательной среды и в стерильных усло.виях смешивают соответственно с 16 и160 мл 507-ной лимонной кислоты, 50БС-питательная среда:Сахароза, г 100,0Янтарная кислота,г 10,0Кислый фосфорнокислыйкалий (первичный),г 55Сульфат магния,гНитрат аммония, гХлористым калии, г 9 4Гидроокись аммония До рН 5, 2-5,3Вода, мл До 1000Питательную среду стерилиэуют порциями по 100 мл в колбах Эрленмейера или в количестве 100 л в полупроизвод" ственном Ферменторе, БТ-агар-питатель. ная среда (В 1 аЕе) отличается от жидкой питательной среды БС тем,. что к ней прибавляют 25 г/л порошка агара. После добавки агара питательную среду кипятят, порциями по 150 мп наливают в бутылочки и стерилизуют.П р и м е р 2. Типичные выращенные на Б 1-агар-питательной среде двадцатидневного возраста колонии С 1 а;хсерз рцгрцгеа ИИС 00186 отделяют от поверхности агара, гомогенизируют в 20 мп стерильного физиологичес кого раствора поваренной соли и 10 мл суспензии прибавляют к 100 мл предварительно простерилизованной находящейся в колбе Зрленмейера (500 мл) Б-питательной среды. Культуру культивируют в течение б дней при 24 С на встряхнвающем аппарате и затем повторно инокулируют на 100 мл находящейся в колбе Эрленмейера (500 мл) питательной среды ТС. После 3 дней ферментации на встряхивающем аппарате 10 мп культуры повторно инокулируют на 100 мп находящейся в колбе Зрленмейера (500 мл) простерилизовачной Бг.-питательной среды, Эту культуру при укзанных условиях культивируют на встряхивающем аппарате в течение 7 дней, После этого она содержит следующие количества алкалои: дов, у/мп: эргокорнин 150, о( -эргокриптин 40 и-эргокриптин 90.П р и м е р 3. Двадцатипятидневную культуру С 1 ач 1 серз рцгрцгеа МЫС 00186 на Б-агар-питательной среде удаляют, соскребая, с поверхности агара и гомогенизируют в 100 мп физиологического раствора поваренной соли. Полученной суспензией инокулируют, 1 л питательной среды СК предварительно простерилиэованной в колбе Эрленмейера объемом 3 л . Культуру встряхивают при 24 С в течение 44 Затем культуру помещают в. Фгрмейтор объемом 15 л, в котором находится 10 л питательной среды ТС -54 . Фер - ментируют при 24 С подаче 0,25 л/л мин воздуха и 240 об/мин, Через 3 дня культуру переносят в кислотостойкий лабораторный Ферментор (150 л)а3 1119609 Ькотором находится 100 л Вй-питательной 100 г валина и 20 г изолейцисредй. Эту культуру культивируютна.при 22 С 150 об/мин и 0,35 л/л мин После ферментации в течение шести подводимого воздуха в течение 6 дней. дней культуральная жидкость содержит На- , 3- и 5-й день к культу у/мп: зргокорнин 320, с(,-эргокриптин ральной жидкости прибавпяют по 60 и /з -эргокриптин 160.Составитель Е.ЯрныхРедактор Л.Веселовская Техред Л.Коцюбняк Корректор С.ЧерниЗаказ 7480/46 Тираж 521 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо деламизобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП"Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4