Способ получения конъюгатов гемагглютинина вируса гриппа с синтетическими полиэлектролитами

01 ОЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ ЕСПУБЛИН 801115754 11 А 61 К 39/395 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЬЮГАТОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИПЕ 1 А С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТА путеь наса троли цплиров ами, о целью дом полиэлекися тем, ммуногенности о и личающ олонгирования кта, в качестве еле о прод пользую 1 ч-винил полиэлсктрол лловой кисл тов и ты и т сополимерыпирролидона. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) 2 й Московский ордена Ленина государ.ственный медицинский институт им. Н, И. Пирогова(56) 1, Петров Р. В. и др. Иммуногенностьконъюгата, полученного путем ковалентнойсшивки бычьево сывороточного альбумина ссополимером 4-винилпиридина и 4-винилацетилпиридинит бромида. ДАН СССР, 1979,т, 249, Н 1, с. 249-252,2. Авторское свидетельство СССР по заявкеИ 3433461/28 - 13, кл. А 61 К 39/44, 29.04.82,3, СЬар 1 го А., Ое Ооапд Вопи ЕогорРо 1 е 1 пег 1., 1978, ч. 10, 1103. ковалентного связывания гемагглютиИзобретение относится к сщтезу биологичес.ки активных соединений, конкретно к способуполучения конънпатов гемагглютинина с полимерами - поли электролитами.Известен способ получения конъюгатов взаимодействием очень слабого иммуногена -бычьего сывороточного альбумина с кватер-.низованным поли-винилпиридином . Иммунизация полученными конъюгатами вызываетиммунный ответ с накоплением специфичес- Оких антителообраэующих клеток (на альбумин), число которых значительно превышаетчисло клеток, накапливающихся при раздель.ном введении животных альбумина и кватернизованного поли.винилпиридина 11.Однако конъюгаты альбумин. поли-винил.пиридин не могут найти широкого практического применения, так как кватернизованныйполи-винилпиридин является весьма токсичным полимером (1 О - 80 мг/кг) и, кроме 20того, получение высоких титров против альбу.мина не является актуальным для современной иммунологии,Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положитель ному эффекту является способ полученияконъюгатов гемагглютинина вируса гриппас синтетическими полиэлектролитами, заключающийся в ковалентном связывании гемагглю.тинина с ацилированными карбодиимидомполиэлектролитами, причем в качестве по.лиэлектролитов используют гетерогенные полиамины 21,Недостатком способа является низкая продолжительность иммуногенного действия полу 35ченных коныогатов - , не более 12 сут(табл, 1).Целью изобретения является пролонгирование иммуногенности целевого продукта,Поставленная цель достигается тем, что со 40 гласно способу получения конъюгатов гемагглю тинина вируса гриппа с синтетическими поли- электролитами путем ковалетного связывания гемагглютинина с ацилированными карбодиш- дом полиэлектролитами, в качестве поли- электролитов используют сополимеры акриловой кислоты и й.винилпирролидона.Сущность предлагаемого способа состоит в ковалентном связывании по реакции аци. пирования карбодиимидным способом соло лимера акриловой кислоты и й винилпирролидона с гемагглютинином в буферном раст. воре (рН 6,8), с ионной силой 0,1 - 1,0 М йаС 1 при 2 - 4 С, В качестве ацилирующего агента используют водорастворимый п.толуол 55 , сульфат- й. 2- (4- морфолиний) этила карбодиимид. Ковалентное связывание гемагглютинина вируса гриппа осуществляют с полимерами различных сос 1 вов и молекулярных масс, Используют сополимеры, содержащие О, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 мол,% акриловой кислоты и с мол, мас. 10000 и 200000. Конъюгат отделяют от несвязавшегося белка и сополи.мера гель. фильтрацией на колонке с сефадексом, Высушивают лиофильно. Идентифицируют полученные конъюгаты по электрофоретическойподвижности, которая отличается от подвиж.ности гемагглютинина и сополимера. Количество связавшегося белка определяют с помощью УФ-спектроскопии и методом Лоури,количество ковалентных связей оценивают порезультатам спектрофотометрического титрова.ния свободных аминогрупп тринитробензолсульфокислотой, Для иммунологических экспе.риментов используют конъюгаты, содержащиеот 50 мкг до 1 мг гемагглютинина на 1 мгконъюгата с количеством ковалентных связей 5 - 20%,Установлено, что полученные конъюгатыустойчивы к биодеструкции и выводятсяиз организма крайне медленно, Эффект вакцины определяется величиной и длительностьюпротективного действия, В случае устойчивыхк биодеструкции соединений длительность воздействия на иммуносистему организма увеличивается. Это важно с точки зрения пролонгирования эффекта вакцины путем увеличениявремени циркуляции конъюгата в кровотоке,а также включения новых клонов клетокиммунной памяти. Устойчивые к биодеструкциисинтетические полимеры позволяют пролонги.ровать иммунные и вакцинирующие свойстваконъюгатов на их основе.П р и м е р, Сополимеры акриловойкислоты и й-винилпирролидона получаютметодом радикальной их сополимеризациив присутствии радикального инициаторанадсернокислого аммония 31, Состав мономерной смеси определяют с учетом известныхконстант сополимеризации мономеров. Сополи.меры выделяют осаждением в эфир, затемдиатизируют и высушивают лиофильно,Содержание акриловой кислоты в сополимере определяют ИК-спектроскопии (1720 см " )и потенциометрическим титрованием. Молеку.лярные массы оценивают вискозиметрически,Синтез конъюгата проводят по реакции ацилирования в присутствии водорастворимогокарбодиимида - П-толуолсульфоната - й.цикло.гексил.й - 2 (4-морфолиний) зтил карбодиимида.30 мг сополимера (мол. мас. 100000,эквимольного состава 50:50) растворяют в2 мл фосфатного буфера (рН 6,8, ионнаясила 0,1 М йаС 1), К раствору сначала добавляют 2 мг гемагглютинина в 0,5 мл тогоже буфера, а затем при перемешивании иТаблица 1 50 2 44 44 40 38 35 34 32 28 28 25 25 24 10 0 3 0 3 24 10 0 5 40 35 32 7 37 3 30 20 10 0 100 100 ыф Поли ивности по време иммунологической аюдеструктируюших но Для сравн конъюгат телях - производных гетероцепн 3 111575охлаждении (2 в 4) 20 мг карбодиимидав 0,5 мл буфере. Раствор выдерживают в течение 24 ч при перемешивании и охлаждении,затем добавляют 0,1 ммоль ацетата натрия.Несвязанные ковалентно белок и сополимер разделяют с помощью гельхроматогра.фии на колоние (1,7 х 80 см), заполненнойсефадексом 6-150, скорость элюирования50 мл/ч, Элюирование проводят 0,05 Мфосфатным буфером (рН 8,2) с ионной силой О1,0 М чаС 1. Раствор диализуют черезполупроницаемую целлофановую мембранусначала против 0,15 М чаС 1, затем противдистиллированной воды в течение 48 ч, Раст.вор высушивают лиофильно,5Количество связанного белка, определенного по методу Лоури и с помощью УФспек.троскопии (280 нм), 100 мкг на 1 мгконъюгата. Количество ковалентных связей,определенных спектрофотометричемким титрованием свободных аминогрупп тринитробензол.сульфокислотой, 17%.Сополимеры различного состава и молеку.лярной массы, а также конъюгаты на их основе различного состава, содержащие различ.ное количество ковалентных связей полученыспособом аналогичным примеру.Изучение иммуногенности конъюгата, полу.ценных согласно примеру.Опыты проводили на мышах. линии СВАи СВАХС 57 В/Р, весом 22 - 24 г, Мышейиммунизировали внутрибрюшинно изолирован.ным гемагглютинином, смесью гемагглютининсополимер и конъюгатом гемагглютинин - сополимер, Через 7 - 8 дней после иммунизации в,ния приведены данные по изменени гемагглютинина вируса гриппа на х полиаминов селезенке животных определяли содержание аи. тителообразующих клеток, используя эритроциты барана, нагруженные вирусом гриппа.Реакцию гиперчувствительности замедленного типа против гемаглютинина индуцировали внутрибрюшинной иммунизацией животных изолированным гемагглюнитином, смесью гемалюгинина с сополимером или конъюга. том.В табл, 1 приведены данные о пролонгиро. ванин иммуногенности полученных конъюга. тов по сравнению с иммуногенностью конъю. гатов, полученных по известному способу. Полученные по предлагаемому способу конъюга. ты сохраняют иммунологическую активность по крайней мере в течени 18 сут, тогда как, конъюгаты гемагглютинина с производными гетероцепных полиаминов в течение 12 сут,При исследовании конъюгатов обнаружено повышение иммуногенности в 44 раза (табл.2), Анализ специфичности указывает на строгую гемагглютинин - специфичность антителообразующих клеток. Иммунизация конъюгатом обеспечивает развитие значительно более выра. женной реакции гиперчувствительности, высота которой превышает в 11 раз таковую в ответ на введение изолированного гемагглютина.Таким образом, использование предлагаемо. го способа позволяет получить также конъюгаты гемагглютинина с полизлектролитами, которые обладают лрологированными иммуно. генными свойствами, сохраняя при этом высокую иммуногенность, специфичность и способ. ность обеспечить при этом развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа.1115754 Таблица 2 Количествоживотных Доза белка, мкг Отношение нмму.нологичес кой Препарат активности Гемагглютинин 80 30 30 100 Коньюгат гема 30 гглютинин - со. полимер 50:50 3500 100 Составитель В. Муронец Техред М. Надь Корректор С. Черни Редактор М. Товтин Тираж 687 ПодписноеВНИИПИ Государственного комщтета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Заказ б 805/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Смесь гемаглюти ниц - сополи.мер 50:50 Гемагглютининспецифиц. анти.телообраз клет.ки