Способ резекции предстательной железы

(191 (И) 5 1) А 61 В 10/00,ЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ки АН 4 ег цгд 963 все 1 п йе.Чо 1, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт биологической физиСССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЯЙЦЕКЛЕТОК И ЗАРО ДЫШЕЙ МЛЕКОПИТАЮШИХ, включаю щий их инкубаеио в синтетической пита.тельной среде с флуорохромом и последующий анализ окрашенных яйцеклеток и аа родышей с помощью микроскопического исследования, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и снижения токсичного действия флуорохрома, в ка, честве флуорохрома используют 8-анилино-нафталено-сульфат илн 2,7-диа,1 ино-атил-фенилфенонтридиумбромид.Изобретение относится к эксперимен.тальной гинекологии и ветеринарии и предназначено для провелеция эмбриологических и криобиологических исследований, Кроме того, оно может найти применение в животноводстве, в частности для определенияжизнеспособности трансплантируемых за.родышей,Известен способ определения жизнеспособности дробя гцихся зародышей млекопитакпцих, основанный на оценке морфоло.гического состояния, заключающийся в том,что путем прижизненной микроскопии оценивают морфологическое состояние дробяшихся зародышей по пятибальной системе,гле учитывается их компактность, симметричность и плотность ).Недостатком известного способа является его малая точность, поскольку отсутсгц ует строгая коореля ци я между оцениваемыми морфологическими признаками ижизнеспособностью зародышей. Как показала практика, часто низкооцеценные группы зародышей оказывались жизнеспособными.Известен также способ определения жизнеспособности оплодотворенцых яйцеклстоки дробящихся зародышей путем прижизненной микроскопии после их культивированияв синтетической питательной среде. Этотспособ заключается в том, что в асепти.ческих условиях под слой специальным образом подготовленного биологически инертного вегцествд, не смешиваюгцегося с водой(вдзели нового или силиконового масла),находящегося в чашке Петри, вносят микрокаплю синтетической питательной среды изатем в нее помешают около О зародышейили оплодотворенных яйцеклеток, ЧашкуПетри переносят в систему, обеспечивающуюполдержание в газовой фазе над биологическиинертным веществом 5 - 10% СО при 37 С, и заполняют систему смесью газов, содержащей 5 - 0% СО. Оплодотворенные яйцеклетки культивируют в течение Рб ч, а дробящиеся зародыши млекопитающих в зависимости от стадии развития - в течение 24 - 72 ч. После культивирования методом прижизненной микроскопии оценивают стадию развитяя. Жизнеспособными считают те зародыши и оплодотворенные яйцеклетки, которые за время культивирования достигли стадии бластоцисты 2.Однако этот способ нельзя применитьдля определения жизнеспособности в двух стадиях зародышевого развитиянеоплолотворенндя яйцеклетка (поскольку онд нс может дробиться) и поздняя бл астоцистд (тдк как в этой стадии зародыш уже необходимо трансплантировать в матку). Способ нельзя использовать перед проведением воздействий па яйцеклетки и дробящиеся зародыши. Кроме того, способ неточен н силу способности частью зародышей ими.тцровдть в холе культивирования процесс40 45 50 этом жизнеспособными считаются клетки, не обладающие флуоресцентным свечением, ажизнеспособными - обладающие им 3.Одним из недостатков этого способа нв. ляется его малая точность, обусловленная тем, что с его помощью определяется наличие активных эстеразцых ферментов в клетке, которое является необходимым, но не достаточным условием жизнеспособности клеток. Так, фрагментируюциеся яйцеклетки, т. е. яйцеклетки заведомо нежизнеспособные, поскольку они не были оплоло. творецы, определялись с помощью метода с использованием ФДА как жизнеспособные, хотя образование флуоресцеина внутри клеток являлось лишь свидетельством активности их эстеразных ферментов, а сами фрагментируюгциеся яйцеклетки были обречены на гибель. Кроме того, показано,что некоторые дробящиеся зародыши, пол" вергавшиеся процедуре замораживания оттаивания и определенные по способу с применением ФДА как жизнеспособные, по дробления путем фрагментации цитоплазмы, в особенности тех зародышей, для получения которых применяют метод гормональной суперовуляции (Егап 1 6,. Арпад о гпоцде 1 п око ада 1 п ч(го,Усцпе(е Йев., 1980, 3,4, 379-393). Наконец, этот способ представляет собой длительный и трудоемкий процесс, занимающий до 96 ч.Наиболее близким по технической сущ.ности к предлагаемому является способ О экспресс-определения жизнеспособностияйцеклеток и лробяшихся зародышей млекопитающих с использованием флуоресцеинлиацетата (ФДА). Этот способ основан на свойстве ФДА, представляющего собой ценолярное нелюминесцируюгцее вещество, легко проникать через клеточную мембрану и под действием эстеразных ферментов превращаться во флуоресцеин - вещество, имеющее высокий квантовый выхол флуоресценции. Образование флуоресцеина из ФДА внутри клетки или зародыша свидетельствует, таким образом, о наличии в них активных эстеразных ферментов, что является необходимым условием их жизнеспособности.Этот способ состоит в том, что лробягцие ся зародыши или яйцеклетки помепдют вкаплю свежеприготовленного физиоло и.чески сбалансированного солевого раствора, содержащего 10М ФДА и инкубируют 1 мин при комнатной температуре (18 -- 25 С), Затеммин дробяшиеся зародыши и яйцеклетки отмывают от ФДА свежими пор.циями указанного растворд (для удаления флюоресцеина, образуюгцегоЬ в межклеточной среде и мешающего наблюдению самих клеток), Затем в капле этой среды их микро- скопируют в проходящем свете и свете люминесценции и по появлению излучения флуоресцеина в яйцеклетках или дробящихся зародышах судят об их жизнеспособности. Прискольку обладали флуоресценцией, имели явно выраженные летальные морфологические повреждения.Другим недостатком метода с применением ФДА является то, что он основан на вмешательстве в жизнедеятельность жизнеспособных клеток и зародышей, так как жизнеспособность определяется по одному из продуктов химической реакции, происходящей внутри клетки, причем в этой реакции участвуют эндогенные ферменты, играю цие определенную роль в ее жизнедеятельности, а продукты реакции остаются внутри клетки и также могут влиять на ее жизнедеятел ьность и на получаемое потомство.Кроме того, способ с использование ФДА требует от мы вки, которая занимает 30/о15 времени всей процедуры определения.. Цель изобретения - повышение точности способа и снижение токсического действия флуорохрома.Поставленная цель достигается тем, что 2 О согласно способу определения жизнеспособности яйцеклсток и зародышей млекопитающих, включакццему их инкубацию в синтетической питательной среде с флуорохромом и последующий анализ окраценцых яйце- клеток ц зародышей с помо)цыо микроскопическс)го исследования, в качестве флуорохромд используют 8 анилццо.-цафталено-сульфат или 2,7-циам иио-О-этил-фенилфеноцлиумбромид.Приме/ /. Оп рсдслсцис жизцсспособнОсти и Йцсслетк и л)с)65 Ии хс 51 за ролышсй после цизкотсмцсрдтур)цй консервации и х)знеци 51 их и)и тс.мцс 1)т,рс )кцдкого азота.Дскоцссрвироваццыс ц омь 1 тыс От криопротектора яйцеклетки и;робяпИсс 51 зародыши млскоцитднщих помещали в капло средь Хсцксд, солерждцук) 1-ацили)ю-нафта лсно-сульфат (или 2,7-диамицо-этил- -фсцил-фсцсцтрилиумбром ила) в концентрациии 10 10 М, выдерживали 2 миц 35 1при комнатной температуре, цросматрива с ли их с цомощьк люмицисцецтного микроскопа в и ргхс)лясцсм свете и свете люм и цссценции 10 с и выявляли яйцеклетки и зародыци, це имевшие лвминесцецтцого свечения, которые определяли как жизнеспособныее.Отобранные таким образом жизнеспособные зародыши подвергали культивированию, которое показало, что 100 О/ их нормально развивается до стадии блдстоцисты. При культивировании яйцеклеток и зародышей, отобранных в качестве жизнеспособных по известному способу, только примерно 5 ОО/о развивалось до стадии бластоцисты и, таким образом, около 50 О/, объектов со скрытыми повреждениями оказались ошибочно определенными как жизнеспособные 55 по известному способу. Более того, даже яйцеклетки и зародыши, имевшие явно выраженные морфологические летательные повреждения, ошибочно определялись по известному способу как жизнеспособные,Таким образом, применение предлагаемого способа позволило примерно в два раза повысить точность определения жизнеспособности яйцеклеток и дробящихся зародышей после их криоконсервации по сравнению с известным способом.Пример 2. Определение жизнеспособности, оплодотворенных яйцеклеток и дробящихся зародышей млекопитающих перед трансплантацией приемным матерям.Оплодотворенные яйцеклетки или дробя.щиеся зародьипи млекопитающих непосред ственно перед проведением трансплантации соответственно в яйцевод или матку помещали в каплю среды Хенкса, содержащую 2,7-дидмино- О-этцл.фсцилфенонтридиумбромил (цси-дци,Ицо-цас 1)тдлен.8-сульфат) в ко 1 счцой концгцтрдцци 10 - 10 М и вы 5 Бдсркивалимцц при комнатной температурс. Здтсм полу сццый препарат просматривали в люминссцснтцом микроскопе в проходящем свете и свете люминесценции в течение 10 с ц выявляли яйцеклетки и или зародыши, цс цмсвцсцс люмццесцецтного све- ЧСсЯ, КОТОрЫС 01 рСДС.,151 ЛИ КдК )КИЗИССПО.собцье ц цспсльзсэвлц для трансплантации.Дальнейшее цаблюлсцис показало нормальное рдзвцтис Отсбранных яйцсклеток и за.родыцсй. При этом 10 осо яйцеклеток и/или дробящихся здроль 1 цсй отбрдковывается кдк нежцзцсспособцыс. Хотя известный спо.соб в этих случаях позволяет отбраковывать кдк нежизнеспособные пример)ю такое жс количество яйцсклсток ц зародышей, как ц црсллагдсмый, Олцдко известный способ цмсст тот цсдостдтск, что внутри определенц,х кдк цея(изцс способные яйцеклеток и заролышсй Остаются чужеродные для клеток цролукты реакции ФДЛ, которые могут в дальнсйцсм повлиять на развитие самих яйцеклсток и/цлц зародышей и на потомство цз цих. Предлагаемый способ лишен .этого целстТкд.ПИгзер Л. Выявление нежизнеспособности фрдмсцтируюшцх яйцеклеток,Заведомо нежизнеспособные фрагментирувщнсся яйцеклетки помещали в каплю средь Хсцксз, содержащую 2,7-дизмино- -10-этил.фсцилфгцсдцтридиумбромида (или 1-И Или цс-цдфтдгсцо-сульфата) в концентрации 1 О 10 М, выдерживали 1 мин при комнатной температуре, просматривали их с иомосцьк) лцмицесцентного микроскопа в п 1 схсляцсм свете и свете люминесценциив 100/о случаев выявляли нежизнеспособность этих яйцеклеток по наличию их люмицесцецтцого свечения в отличие от результатов, пслучдсмых известным способом, который.ошибсишо Определяет все 00/о этих заведомо цсжцзцс способных яйцеклетокскак жизцеспособцьц ., жизнеспособных яйцеклеток и зародышей и потому перед трансплантацией их животному - реципиенту необходимо провести жесткую процедуру отмывки их от внутри- клеточного красителя. Такая отмывка от внутриклеточного красителя клеток, полученных по известному способу, занимает 2 ч при 37 С и приводит к резкому увеличению длительности анализа и неконтролируемому повреждению 60 - 80% яйцеклеток и зародышей, определенных как жизнеспособные по известному способу. Это приводит к низкой (20 - 30 о/о) приживляемости с последующим развитием в организме животных - реципиентов зародышей и яйце- клеток, определенных как жизнеспособные по известному способу.Наконец, предлагаемый способ благодаря применению красителей с переменным квантовым выходом не требует дополнительной операции отмывки клеток от вцеклеточного флуорохрома, мешающего в известном способе наблюдению яйцеклеток и зародышей с помощью люмицесцецтного микроскопа. Эта операция включает в себя отбор с помощью микропипетки под бянокулярным микроскопом каждого ацализируемс го объекта, помещение его в синтетическую питательную среду для отмывки и затем снова под люминесцентный микроскоп для анализа на жизнеспособность. Г 1 роцесс отмывания, необходимый согласно известному способу, занимает це менеемин и становится особенно длительным при массовом анализе объектов. При осуществлении этого процесса согласно известному способу повреждактся до 15 - 20% клеток уже после того, как они прореагировали с красите.Тем ,(ФЛА), и потому эти поврекденные клетки по известному способу ошибочно определянт ся как жизнеспособные. 10665523Таким образом, использование, Оредла.гаемого способа в сравнении с известным обеспечивает следующие преимущества.Повышение точности определения жизнеспособности. Как видно иэ примера 3, благодаря применению специально подобран.ных красителей, особым образом взаимодействующих с мембраной яйцеклеток и зародышей, предлагаемый способ, в отличие от известного, позволяет определить нежизнеспособность фрагментирующихся 1 О яйцеклеток (т. е. имитирующих процесс дробления путем фрагментации цитоцлазмц), Кроме того, как видно из примера 1, предлагаемый способ позволяет более точ.цо определить жизнеспособность зародышей, подвергавшихся процедуре эаморажива ния - оттаивания в процессе криоконсервации, в то время как известным способом определяли как жизнеспособные даже зародыши, имевшие явно выраженные летальные морфологические повреждения.20Значительное понижение вредного влияния тестирующего вещества ца анализируемые яйцеклетки и зародьпци. поскольку ис-, пользуемые в предлагаемом способе флуорохромы практически не проникают в жизнеспособную клетку за время проведения аца лиза (1 - 3 мин). Это позволяет исключить возможность повреждаюгцего влияния тестирующего вегцества как ца объект анали эа, так и на отдаленное его потомство.Исключение проникновения красителей внутрь жизнеспособных клеток является важным преимуществом предлагаемого нами способа, так как определенные с его помогцью как жизнеспособные яйцеклетки и зародыши могут быть сразу же использованы для трансплантации животномуреципиецту, в отличие от известного сцособа, в котором краситель проникает внутрьСоставитель Л. Макаров Редактор М, Циткина Техред И. Верес Корректор М. Ш а ро гн и Заказ 10844/5 Тираж 893 Подгп . ное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изоеретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4