Способ количественного определения биологически активного вещества

СОВЕТСКИХ НИЕ ИЗОБРЕТ Н АВТОРСМОМУ. СВИДЕТЕЛЬСТ(71) .Московский ордена Ленина и ордна Трудового Красного Знамени госуларственный университет им. М.В.Ломносова(Р) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕ"ДЕЛЕНИЯ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА путвм инкубации исследуемогоматериала со сьецифической сыворот- .кой в присутствии меченого исследуро- емого биологически активного вещества, взятого в определенной концент.- рации, с поаледующим учетом непроре-. Б- агировавеего меченого вещества, о т"л и ч а ю щ и й с я теи, что, с о целью повывения чувствительности спо"саба, инкубирование проводят в .при". сутствии биологически активного ве"щества, маченого никотина-мидадениндинуклеотидом или аденозинтрифосфа"том. ГОСУДАРСТВЕННЬФ КОМИТЕТ СССРт д пю аа пиа и оЮнъЭИИзобретение относится к медицинеи касается способа количественногоопределения биологически активноговещества,Известен способ количественногоопределения антигена с помощью флюоресцирующих красителей 1 ).Известен также способ количественного определения биологически активного вещества БАВ ) путем инкубацииисследуемого материала со специфической сывороткой в присутствии меченогоисследуемого БАВ, взятого в определенной концентрации с последующимучетом количества непрореагировавшего меченого вещества. Чувствитель-зность для стероидных гормонов 1 О м,для инсулина 1 О м 2),Однако известный способ не обеспечивает высокой чувствительности способа,Целью изобретения является повышение чувствительности способа.Цель достигается тем, что согласно способу количественного определения биологически активного веществапутем инкубации исследуемого материала со специфической сывороткой вприсутствии меченого исследуемогобиологически активного вещества, взятого .в определенной концентрации, споследующим учетом количества непрореагировавшего меченого вещества, инкубирование проводят в присутствиибиологически активного вещества,меченого никотинамидадениндинуклеотидом или аденозинтрифосфатом.Меченое НАД БАВ получают путеммодификации НАД по С - аминогруппе аденинового кольца с последующимсвязыванием модишицированного кофермента с БАВ карбодимидом. П р и м е р 1. Определение инсулина, Построение калибровочной кривойдля определения инсулина в растворе.1 мл раствора инсулина в фосфатном буфере рН 7,8 , содержащем стандартные количества (0,05; О, 1;0,5; 1,5; 1 О; 20; 40; 60; 100 и 200 нм инсулина, инкубируют с200 мкл имунной сыворотки морской свинки против инсулина свиньи, разведенной в 000 раз и 1 мл 10 М раствора комплекса НАД - инсулин (никотинамида-дениндинуклеотид-инсулин) в течение 2-25 мин при 25 С. После инкубации 0,1 мл раствораинкубационной смеси вносят в кюветуспектрофотометра, содержащую 1,9 мл0,05 М калий-фосфатного буферарН 7,4,0,1 мл смеси НДМА (паранитрозо-М М-диметиланилин) и циклогексанола/НДМА растворяют в циклогек-саноле до концентрации 40 мМ,а заО тем разбавляют 0,05 М калий-фосфатным буфером до концентрации300 мкМ/мл и 0,1 мл алкоголегидрогенаэы. Измеряют убывание восстановленной формы НДМА по изменению опти 1 ческой плотности при 440 нм. Калибровочная кривая представлена на фиг.1Определение инсулина осуществляютследующим образом.1 мл сывооотки крови человека,разведенной в 10 раз калий-фосфатнымбуфером, инкубируют с 200 мкл сыворотки морской свинки, содержащей антитела к инсулину, разведенной в100 раэ и 1 мл 10 " М раствора НАДд инсулин, после чего вносят в кюветуспектрофотометра для измерения скорости восстановления НДМА, Все остальныереагенты добавляют в тех же соотношениях, что и при построении калибЗО ровочной кривой, Определяют концентрацию инсулина по калибровочной кривой,П р и м е р 2. Определение 17зкстрадиола,Для построения калибровочной кривой 1 мл раствора 17-Р-экстрадиолав 0,05 М калий-Фосфатном буфере (рН7,8), содержащий стандартные количетсва 0,4; 0,8; 1; 1,5; 2,О; 20;0 50 и 00 нг) инкубируют с 1 мл 1 ОМ раствора комплекса НАДэкстрадиола с бычьим сывороточным альбумином БСА) разведенным в 100 раз, втечение .20 мин при 25 С. Доза и раз ведение антисыворотки подбирают поингибированию скорости восстановления НДМА на 60.Определение 17 зкстрадиолаосуществляют аналогично примеру 1.Чувствительность определения биологически активных веществ достигает 1 О -. 10 М, в частности для ин-.сулийа О М.Для получения комплексов аденозинтрифосфат (АТФ) с БАВ АТФпредварительно модифицируют до АТФй-й -(6- аминогексил)-ацетамида изатем ковалентно связывают с соот;ветствующим биологически активным1022712 веществом в присутствии растворимого карбодиимида.П р и м е р 3. Определение инсулина. Построение калибровочной кривой. 1 мл раствора инсулина в 0,1 М трис- ацетатном буфере (рН 7,8), содержащем стандарнтные количества (5 ф 10; 20; 40; 60; .100 и 200 нг) инсулина инкубируютсо 100 мкл иммунной сыворотки морской свинки против ин сулина свиньи, разведенной в 1000 раз и 1 мл 10 И раствора комплекса АТФ-инсулин в течение 20-30 мин при 3 С. 15Для работы используют обьем и разведение исходной антисыворотки; вызывающей ингибиование биолюминес- . ценции 1 мл 10" М раствора комплек-оса АТФ-инсулин на 8 Я.20 После инкубации 0,5 мл реакционной смеси вносят в кювету биолюминометра, содержащую 1 мл 0,1 М трисацетатного буфера, рН 7,8; 0,2 мл 7 0,1 М раствора МфО 0,2 мл 0,4 ММ . раствора.люцеферина и 0,2 мл раствора люцефиразы в том же буфере и измеряют интенсивность биолюминесценции. Калибровочная кривая пред ставлена на фиг.2. По получении калибровочной кривойможет быть определено содержание инсулина в образце биологической жидкости, 1 мл сыворотки крови человека, разделенной в 10 раз,(0,1 мл сы" воротки и 0,9 мл трис-ацетатного буфера, рН 7,8) инкубируют со 100 мкл имунной сыворотки морской свинки,ф 1 О разведенной в 1000 ваз, и 1 мл 1 О И раствора комплекса АТФ-инсулин в течение 20 мин при 3 С, после чего 0,5 мл реакционной смеси вносят в кювету для измерения интенсивности биолюминесценции. Все остальные реа" генты добавляют в кювету в тех же соотношениях, что и при построении калибровочной кривойЛ 1 о полученному значению интенсивности с помощью калибровочной кривой определяют концентрацию инсулина. Чувствительность определения около 10 И.42П р и м е р 4. Определение концентрации ампициллина.Для проведения иммунной реакции используют антисыворотку, полученную к конъюгату ампициллин-бычий сцвороточный альбумин ( БСА), доза и разведение которой подбирают зкспери" ментально в зависимости от активности и титра антител. 8 качестве меченого стандарта используют 10 .И раствор комплекса АТф-ампициллин,Использование способа йоэволяет повцсить чувствительность определения, сократить время проведения анализа.аказ 4098/3 Тираж 713 ВНИИПИ Государственного комитет по делам изобретений и от 113035, Москва, Ж, Раушская