Способ определения барбитуратов в биологических жидкостях

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61)Дополкительное к авт, сеид-ву (22) Заявлено 080581 (21) 3285448/28-13 Союз Советских,СоциалистическихРеспублик 11964532 Рф 3 М. Кл.з 6 03 М 33/48 с присоединением заявки Нов Государственный комитет СССР по делам изобретений н,открытийДата опубликования описания 071082. , К Вше А.А,Колдаев, О.Д.Протасова и Н.Й (КотсЩиалаалщ ТЕХНИ Центральный ордена Ленина институт усовешенсрраЬццт аеас,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАРБИТУРАТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХИзобретение относится к медицине,а.именно к способам диагностики острых отравлений,Известен способ определения барбитуратов в биологических жидкостяхпутем их выделения, очистки и резкстрации целевого продукта с последующим спектрофотометрированием пробы 1Однако использование известногоспособа связано со значительными нотерями барбитуратов, использованиемспециальной дорогостоящей сублимаци-.онной и вакуумсублимационнойаппаратуры и значительными затратами времени (только на операцию очистки -от 24 ч до 40 мин) наряду с другимиоперациями в методике определения,что снижает точность получаемых результатов и затрудняет применениеспособа в условиях лабораторий центфров по лечению отравлений. Целью изобретения является повышение точности способа.Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа определения барбитуратов в биологических жидкостях путем их выделения, очистки и реэкстрации целевого продукта с последующим спектрофотометрированием пробы., биолодическую жидкостьпредварительно инкубируют с оливковым маслом в течение 1-1,5 мин.Способ осуществляют следующимобразом.Перед изолированием препаратовпроводят очистку путем инкубации соливковым маслом в течение 1 минвстряхиванием в пробирке. После этого проводят определение барбитуратов,В пробирку помещают плазму больного(0,5-1,5 мл), затем добавляют оливковое масло в количестве 1 мп и встря"хивают пробирку в течение 1 мин, Для 15 разделения полученной смеси оливкового масла и плазма пробы центрифугируют в течение 1 мин при 3001000 об., после чего проводят заборплазмы для дальнейшего исследования.Следующей стадиеи определенияявляется извлечение препарата из биологической жидкости. В две пробирки,с притертыми пробками на 10-20 мпналивают по 8 мп хлороформа, В,однуиз них переносят 1 мп плазмы, очищенной маслом. В другую - такой же объемстандартного раствора барбитурата,разведенного 0,1 н. раствором йаОНдо предполагаемой концентрации, Затемсодержимое пробирок подкисляют концентрированной соляной кислотой(0,6 мл НСВ на 0,5 водной фазы),Далее добавляют сернокислый безводный натрий до полного связыванияводной фазы (3-4 г и более). Содержимое пробирок энергично встряхивают в течение 1 мин. Затем проводятреэкстракцию и очистку, для чегохлороформные вытяжки отфильтровывают и берут по б мл в две пробиркис притертыми пробками, Туда же до" 10бавляют по 4 мп 0,1 н. раствора МаОНПробирки энергично встряхивают в течение 1 мин, после чего проводятспектрофотометрические измерения.Для быстрого разделения слоев пробыцентрифугируют при, 3000-5000 об/минв течение 10 мин. Осторожно, не нарушая границы раздела двух слоев, пипеткой отбирают по 3 мл верхнего щелочного слоя из каждой пробирки и переносят в прямоугольные кварцевые кюветы с толщиной слоя 10 мм. В контрольную кювету наливают 3 мл 0,1 н.раствора МаОН.Во всех трех кюветахс опытным стандартным и контрольным растворами рН был равен 13,0.Определяют величины оптической плотности при следующих длинах волн: 228,232, 235, 240, 247, 249, 252, 260 и270 мкм без светофильтра с водородной лампой и сурмяноцезиевым фотоэлементом против контрольного раствора. Добавляют в кюветы, в,ключаяконтрольную, по 0,44 мл боратногораствора. При этом рН становится равной 10,0, Сноваопределяют оптическую плотность при тех же длинахволн, Объем добавленного баратного, раствора может быть иным. Содержание барбитуратов вычисляют по разнице оптической плотности при рН 4013,0 и 10,0 и и 260 мкм,1П р и м е р. На исследование были взяты пробы крови больного, отравленного люминалом, и донорская кровь 45 экспериментально затравленная вероналом и нембуталом, Пробы крови центрифугируют для получения плазмы. Затем в первую пробирку помещают по 2 мл плазмы, затравленной вероналом, во вторую - затравленной нембуталом, в третью - йлазму больйого,отравленного люминалом.Для очистки плазмы от сопро" вождакицих веществ, мешающих определению, во все пробирки добавляют по 1-1,5 мл оливкового масла. Встряхи ванием в течение 1 мин проводят инкубацию плазмы .с оливковым маслом. Затем пробы центрифугируют в течение 1 мин при 1000 об/мин, Следующим этапом проводят изолирование верона ла, нембутала и люминала. В шесть пробирок на .10-20 мл наливают по 8 мл хлороформа, в три из них переносят по 1 мл плазмы из первой, второй и третьей пробирок. В три другие - 65 такой же объем стандартного раствора вербнала, нембутала и люминала, разведенных 0,1 н, раствором МаОН до предполагаемой концентрации. Затем содержимое пробирок подкисляют концентрированной соляной кислотой, Далее добавляют сернокислый безводный натрий до полного связывания водной фазы. Содержимое пробирок энергично встряхивают в течение 1 мин. Затем проводят очистку и реэкстракцию, ХлороФормные вытяжки отфильтровывают и берут по б мл в шесть пробирок с притертыми пробками, Туда же добавляют по 4 мл 0,1 н. раствора МаОН. Пробирки энергично встряхивают в течение 1 мин. После чего проводят спектрофотометрические измерения. Предварительно пробы центрифугируютпри 3000-5000 об/мин в течение 10 мин.Затем пипеткой отбирают по 3 мл верхнего слоя поочередно из каждой про"- бирки и переносят в кварцевые кюветы спектрофотометра. Измерения проводят в три этапа, Первый этап исследуются пробы с вероналом, стандартным раствором веронала, второй этап - пробы. с нембуталом, стандартным раствором нембутала, третий этап - пробы с люминалом, стандартным раствором люминала. В контрольные кюветы во всех трех этапах наливают по 3 мл 0,1 н. раствора МаОН. Определяют величины оптических плотностей при длинах: 228, 232, 235, 240, 247, 249, 252, 260 и 270 мкм сначала при рН 13,0. Затем добавив по 0,44 мл боратного раствора во все кюветы, включая и контрольные,измеряют оптическую плотность при рН 10,0. После проведения исследования содержание экстрактивных веществ, мешающих спектрофотометрическим измерениям, резко снижается. Это приводит к получению кривой спектра поглощения исследуемого барбитурата к эдентичному соответствию кривой спектра поглощения "чистых растворовф, растворов барбитуратов в воде.Предложенный способ является"бдлее точным, позволяет в результатеоднократного исследования,обеспечи".вающего практически полное отсутствиевеществ, мешающих определению, полу" чить классическую барбитуровую кривую, позволяющую дать качественную и количественную оценку содержания препарата в крови. Кроме того, получение классической точной кривой спектра барбитуратов позволяет в ряде случаев устранить. операцию качест"венного определения при установлениипринадлежности неизвестного веществак классу барбитуратов.формула, изобретенияСпособ определения барбитуратовв биологических. жидкостях путем их964532 Источники информации,принятые во внимание при экспертизеСоставитель Ю.Алмазов Редактор О.Юрковецкая Техред,М.Гергель Корректор;А.Гриценко е ее е ев Заказ 7620/24 тираж 887 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП фпатентф, г.ужгород, ул.Проектная, 4 выделения, очистки и реэкстракдиицелевого продукта с последующимспектрофотометрированием пробы, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения точности способа, биологическую жидкость предварительйоинкубируют с оливковым маслом в течение 1-1,5 мин. 1. Кокшарова Н.В. Хроматография в тонком слое как метод определения барбитуратов при химико-токсикологических исследованиях. М., "Медицинаф, ,1966 с. 3.