Способ получения урокиназы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Н ПАТЕНТУиковано 07,05.82 бюллетень17 та опубликования описания 09.0 Иностранцыуо, Маргрет Джин Ринтс(сшА) 7) Заявител 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРОКИНАЗЫ Изобретениеотносится к химикофармацевтической промышленности икасается получения лекарственныхпрепаратов,Известен способ получения урокиназы путем культивирования культурыпочечной ткани в жидкой питательнойсреде в присутствии аминокислоты споследующим выделением целевого про"дукта 11.Однако известный способ не обеспе"чивает высокого выхода целевого продукта.Цель изобретения - повышение выхода урокиназы.Указанная цель достигается тем,что при осуществлении способа получе"ния урокиназы путем культивированиякультуры почечной ткани в жидкой питательной среде в присутствии амино"кислоты с последующим выделением целевого продукта культивирование ведутв присутствии 0,3-0,5 Фенилаланина.Способ осуществляют следующим об"разом. Почечные клетки выращивают в соответствующей питательной среде в сосудах для тканевых культур при 35-37 РСдо слияния клеток. Среда 199 являетсятипичной, подходящей средой роста.Можно также испольэовать модифицированную среду Еад 2 е по ОоВЬесео, сре"ду 5 А по МсСоу, среду МВ 752/1 поЯауеоцсЬ и другие общепринятые средыдля тканевых культур. Во время ростакультуральную среду укрепляют сывороткой млекопитающих, например сыво"роткой эмбриона крупного рогатогоскота, в количестве 5"15 по обьему, 1 к среды.После слияния клеток их промываютфизиологическим раствором, напримербуферным рассолом, и затем промывнуюжидкость заменяют консервирующим ве ществом.Можно использовать водную питательную среду, которая является необходимой для сохранения почечных клеток и для получения урокиназы. Эта 25 среда содержит гидролизат белка моло6 аАнализ урокиназы производят путем двухступенчатого метода с помощью йодированной фибрином плитки. В первой стадии урокиназа действует на плазминоген с образованием плазмина, Во второй стадии плазмин гидролизует радиоактивномеценый сгущенный фибриноген (фибрин) с выделением фибринопептидов в раствор, измеренных гамма-счетчиком. Активность урокиназы затем относят пропорционально к радиоактивности, выделенной в раствор. Единицу активности урокиназы определяют как количество энзима, который гидролиэует один мгк фибрина за час.П р и м е р 2. Нормальные первичные клетки почки человеческого эмбриона культивируют до слияния в колбах Т, как описано в примере 1, также промывают в стерильном соляном растворе и удаляют 90 мл консервирующего вещества, фенилаланин добавляют в каждую колбу. Среду пополняют свежей средой, которую добавляют в колбу объемом 30 мл каждые трое суток. По истечение девятисуточного культивирования в фенилаланине среду удаляют, клетки промывают несколько раз и определяют содержание ДНК и титры урокиназы как в примере 1. В данном примере консервирующее вещество состоит из 13,75 г/л среды гидролизата лактальбумина, 2,2 г/л йаНСОи 0,1 вес.Ф Д-глюкозы, Аминокислоту и/или человеческий сыворотоцный альбумин (ЧСА) добавляют в основное консервирующее вещество для получения желательной конечной концентрации (в вес.4),и е аюТитры урокиназы1 1 Общее количество ДНКф, (мкг) Добавки 6 1 3 6 3 1 285 8 13,5 7,4 4,8 298,5 22,4 11)9 11,7 3083 26,3 24,8 17,0 264,0Без добавки0,1 Ж ЧСА0,1 Ж ЧСА + 0,3 глицин0,1 Ж ЧСА + 0,5 Ж глицин 3 92712ка, альбумин человеческой сыворотки,глюкозу и бикарбонат натрия. Кромегидролизата белка молока, можнотакже использовать и другие белковыегидролизаты, такие как триптол, триптоэу, пептон и другие материалы.П р и м е р 1. Нормальные первичные клетки почки человеческого эмб"риона (ПЧЗ) центрифугируют и пересуспендируют в среду 199, содержащую 1 о10 по объему сыворотки эмбриона крупного рогатого скота. Клеточную суспензию применяют для инокуляции пластмассовым колб фалькона емкостью 75 см:одержащих ту же среду в количествах 15достаточных для того, чтобы конечныйобъем культуры составил 15-0 мл, аплотность клеток 1,5-2,0 10 клетокна мл. Колбы инкубируют при 37 С винкубаторе с содержанием 5 СО в . 20воздухе. Среду в колбах меняют каждые2-3 сут до слияния культур. Затемклетки в каждой колбе промывают 25 млстерильного, физиологически нормаль"ного соляного раствора. 25После удаления промывного раствора 1 О мл консервирующего веществасодержат 13,65 г/л среды гидролизаталактальбумина; 2,2 г/л йаНСО,0,1 вес.6 сывороточного альбумина це- звловека; 0,1 вес,3 Д-глюкозы и0,5 вес.3 фенилаланина. Из консервирующего вещества отбирают пробу длятитров урокиназы и его пополняют ежесуточно 10 мл того же свежего консервирующего вещества. По истечении четырехсуточного .культивирования среду удаляют и клетки в каждой колбепромывают несколько раз 25 мл соляно, го раствора и затем 1 н. растворомйаОН. Анализ показывает, цто содержание ДНК в клетках почки целовецеского мбриона составляет 9 мкг ДНК(10 эклеток ),Аналогично примеру 1 активностьурокиназы определяют в мл на деньи мкг ДНК.Сравнительные, данные по выходуурокиназы представлены в таблице.927126 Ьтаблицы ПродолжениетТитры урокиназыю ОбщееколичествоДНКееетааа ивЗаказ 3019/50 Тираж 505 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113036 Москва Ж"36 Рамшская наб. д. 4/536 д "36 у , д, 5Филиал ППП ППатент.",. г. Ужгород, ул. Проектная, 4 0,5 Фенилаланин 46,7 270 . 19 9 118,8жеЕе ае е в щ Е Е Ю Щ тлювКонечное содержание ДНК в клетках в каждой колбепо истечении девятисуточного культивирования в консервирующем веществе.ю мВыход урокиназы, полученный куль- ткани в жидкои питательнои среде в тивированием почечных клеток при ис З присутствии аминокислоты с последую- пользовании повышенных количеств Фе- щим выделением целевого продукта, нилаланина в консервирующем вещест- о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, ве, в основном, выше, чем при ис- с целью повышения выхода урокиназы, пользовании других аминокислот гли- культивирование ведут в присутствии цина,. метионина, гистидина. Это улуч-Зв 0 3-0,5 Ф Фенилаланина. шение достигается и тогда, когда число клеток (т.е. содержание ДНК) по- Йсточни ки инФормации, нижается. принятые во внимание при экспертизеФормула изобретенияСпособ получения урокиназы путем и 1. Патент СЮА У 3930945, культивирования культуры почечной кл. 195-1.7, опублик 1976.