Способ индикации внутриклеточноговируса

и 840102 ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоцкапнстнческихРеспубликао делам изееретеннй нетхрытвйДата опублнковання описания 23.06.81(72) Авторы изобретения Б. Королев, Т. А. Ив Институт полиомиелита и вир Академии медицинск ных энцефалитов .;:ихнаук СССР) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГ ВИРУСА Способ осуществляется следующимобразом.Клетки культуры ткани механическиотделяют от стекла и вместе с куль туральной жидкостью центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5-10 мин, Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1-2 капли иммунной сыворотки, в которой ресуснендируют осажденные клетки. Каплю полученной взвеси Опереносят на металлическую пластинку и подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию попеременным цс мещением пластинки на поверхность сухого льда и ладони руки.Каплю взвеси ресуспендярованньтх всыворотке и лизировщпых в результате замораживания и оттаивания клеток помещают на предметное стекло и инкубируют в течение 15-30 мин во влажной камере (чащка Петри со смоченной водой фильтровальной бумагой). Затем на каплю накладывают предметные сетки, спустя 1-3 мин, ополаскивают их дистил 15вляетсявысокой Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии.Известен способ индикации внутрикпеточного вируса с помощью иммуно электронной микроскопии, заключающийся в получении комплексов аггрегированных иммунной сывороткой вирусных частиц с последующей их визуализацией в электронном микроскопе 1Известен также способ индикации внутриклеточного вируса путем разрушения вируссодержащих клеток или кусочков органного. материала замораживанием и оттаиванием 12.Однако известный способ ятрудоемким и не обеспечиваетчувствительности.Цель изобретения - повьппение чувствительности и упрощение способа.Эта цель достигается тем, что перед замораживанием клетки или кусочки ор ганного материала ресуспендируют в иммунной сыворотке. ова.Ъ В.,М. Лисак=- "ъ1024 840 25 40 50 55 злированной водой (в целях удаления несвяэавшейся сыворотки) и подвергают не гативному контрастированию.При необходимости выявления и идентификации вирусов в тканях и органах небольшие кусочки (около 1 мм ) пос 3 ледних помещают на металлическую пластинку, подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию, добавляют 1-2 капли разведенной антисыворотки, ресуспендируют в ней лизированную ткань ковшом пастеровской пипетки, снова подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию и далее обрабатывают так же, как клетки культуры ткани.П р и м е р 1, Выявление и идентификация вируса Синдбис в культуре клеток почек китайского хомяка.Вирус Синдбис обычным образом выращивают в культуре клеток почек китайс кого хомяка в 100 мл флаконах прио37 С. Исходный титр вируса, используем ого для заражения, составляет 5-15 БОЕ/мл. Спустя 24 ч после заражения клетки механически снимают со стекла и центрифугируют вместе с культуральной жидкостью в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, ее следы удаляют фильтровальной бумагой. К клеточному осадку до-, бавляют 1-2 капли иммунной сыворотки в разведении 1:10 и ресуспендируют в ней клетки концом пастеровской пипетки. Каплю полученной взвеси переносят на металлическую пластинку диаметром 1-3 см и подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию попеременным помещением пластинки на поверхность сухого льда и ладони руки. После этого каплю взвеси лизированных в результате замораживания и оттаивания и ресуспендированных в сыворотке клеток помещают на предметное стекло и инкубируют в течение 15-30 мин во влажной камере (чашка Петри со смоченной водой фильтровальной бумагой). Затем на каплю накладывают предметные сетки, покрытые формваром и углеродом спустя 1-3 мин ополаскивают их дистиллированной водой и наносят каплю фосфорновольфрамовой кислоты с рН 6,5, избыток которой удаляют краем фильтровальной бумаги. После этого сетки просматривают в электронном микроскопе при увеличении 40000- 50000. Выявляют одиночные или аггрегированные вирусные частицы покрытые ареолом антител сыворотки. Контролем специфичности реакции служат клетки ресуспендированные в дистиллированной . 5 10 15 20 55 45 воде, нормальной или гетерологичной сыворотке.П р и м е р 2 . Выявление и идентификация вируса клешевого энцефалита в культуре клеток почек эмбриона свиньи.Вирус клешевого энцефалита (штамм 718) выращивают обычным образом в пробирочной культуре клеток почек эмбриона свиньи. На 2-ые сутки после заражения клеточный монослой механически снимают со стекла пробирки и далее обрабатывают согласно примеру 1, за исключением того, что иммунная сыворотка используется в разведении 1:4. При электронномикроскопическом изучении в препаратах выявляют аггрегаты полных и пустых вирусных частиц.П р и м е р 3 . Выявление и идентификация вируса Западного Нила в культуре клеток комаров АЕде аерчр 0 Культуру клеток комаров А с 3 ецурО выращивают в 50 мл флаконах на обогащенной среде Сс 10 Ъ нормальной тео лячьей сыворотки и инкубируют при 26 С После сформирования монослоя клетки заражают вируссодержащей суспензией мозга новорожденных белых мышей с титром, вируса 7,5-8,0 2.Э 50 мл.После адсорбции вируса его удаляют из флаконов, клетки промывают ростовой средой добавляют среду Сс 5 О/О нормальной телячьей сыворотки. Перевивки зараженной культуры проводят каждые 5-6 сут. После трех субкультивирований зараженные культуры помещают в условия субоптимальной температурыо(10-20 С) на 30 сут, меняя затем температурный режим на оптимальный (26 С). Для анализа берут материал на третьи сутки после заражения, на 30 сут инкубации при субоптимальной температуре и на первом пассаже после изменения температурного режима на оптимальный. Обработку материала ведут согласно примеру 1. Иммунную сыворотку используют в разведении 1:5. В препаратах выявляют агрегаты покрытых, антителами вирусных частиц.П р и м е р 4 . Выявление и идентификация вируса Западного Нила в мозгу Новорожденных белых мышей. Для заражения используют слив культуральной жидкости с культуры клеток комаровА аЕррО , хронически инфицированной вирусом Западного Нила, 0 03 мл культуральной жидкости вводят в мозг новорожденных белых мьпцей. На 3 сут после заражения мышей забивают, выделяют небольшие кусочки (около 1 мм )