Способ разделения липидов рыбьегожира ha фракции

Сфвз Сфветскнх Социалистических РеспубликОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВКДНИЛЬСТВУ(22) Заявлено 05. 04. 78 (21) 2600196/28-13с присоединением заявки Йо(щ 824 054 ре)м ЗС 01 М 33/92 Государственный коюнтет СССР по делаю изобретений и открытийДата опубликования описания 23. 04 . 81) Заявитель 54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ РЫБЬЕГО ЖИР НА ФРАКЦИИ 2 и 1Изобретение относится к медицине ч биологии, а именно к биохимическому анализу для контрольно-аналитических и научно-исследовательских ,работ.ГИзвестен способ разделения липидов рыбьего жира на фракции путем нанесения его на силикагель с последующим элюированием Фракций липидов оргайическими растворителями Ц,Недостатком известного способа является низкая точность способа,что не обеспечивает полного и четкого перехода от одной Фракции к другой и получаемый элюат содержит два и более компонентов,.Цель изобретения - обеспечение воэможности повышения точности способа,Укаэанная цель достигается тем,что при осуществлении способа раэделения липидов рыбьего жира на Фрации путем нанесения его на силикагель с последующим элюированием Фраций липидов органическкмкрастворителями, силикагель предварительнообрабатывают раствором щелочи, изнанесенного, образца последовательновначале этиловым эфиром, затем метанолом элюируют смесь нейтральных липидов и фосфолипидрв, после чего 2 раствором муравьиной кислоты в эфире элюируют.неэстерифицированные жирные кислоты, далее смесь элюатов нейтральных липидов и Фосфолипидов концентрируют, помещают на силикагель, смесью гексана с диэтиловым эфиром, взятых в соотношении 98:2, элюируют фракцию эфиров стеринов, после этого теми же элюэнтами в соотношении 80:20 элюируют холестерин и дмглкцериды, из оставшегося на сил кагеле адсорбата вначале диэтиловым эфиром вымывают моноглицериды, а за тем смесью хлороформа и метанола в соотношении 20 г 80 элюируют фракцию Фосфолкпкдов.Способ осуществляют следующим образом.Предварительно обрабатывают раст вором щелочк склккагель, что обеспечивает высокую активность адсорбента и иеэстерккцированным жирным кислотам и необходима для отделения иеэстерифицкровакных жирных кислот от нейтральных липкдов и фосфолипидов, так как происходит связывание неэстеркфицкрованных жирных кислот и их адсорбцкя на колонке в виде .солей. Использование для промыванияколонки этилового эфира и метанола позволяет элюировать нейтральные ли" пиды и Фосфолипиды. Для элюирования неэстерифицированных жирных кислот, адсорбированных на силикагеле,применяют 2 раствор муравьиной кислоты в эфире. Это позволяет получить хро(матографически чистую фракцию неэсте" рифицированных жирных кислот.Применение для элюирования фракции нейтральных липидов и фосфолипидов на второй хроматографической ко.лонке в качестве растворителей смеси гексан-диэтиловый эфир в определенных соотношениях с возрастающей долей полярного компонента (за счет последовательного увеличения количества диэтилового эфира) позволяет получать фракции липидов со все возрастающей полярностью. Предлагаемые соотношения растворителей обеспечивают четкое разделение компонентов анализируемой смеси, Так, смесь растворителей гек-.сан-диэтиловый эфир, взятые в соотношении 98:2, позволяет выделить наименее полярную фракцию - эфиры стеринов. Промывание колонки этой же смесью растворителей, но взятой в соотношении 90:10, где увеличена доля полярного компонента (диэтилового эфира), позволяет выделить более полярную, по сравнению с предыдущей Фракцией, Фракцию триглицеридов, Использование же вышеуказанной системы растворителей в соотношении 80:20 еще более увеличивает полярность смеси и позволяет выделить близкие по полярности фракции холестерина и диглицеридов. Промывание хроматической колонки только,циэтиловым эфиром в количестве 100-120 мл :позволяет элюировать моноглицериды - наиболее полярную фракцию. В последнюю очередь хроматографическую колонку промывают системой растворителей хлороформ-метанол (в соотношении 20;80), что обеспечивает выделение полярных липидов (фосфолипидов).П р и м е р. В качестве объектаисследования берут навеску липидов медицинского рыбьего жира в количестве 80 мг, растворяют в 2 мл хлороформа и наносят на колонку 1. Предварительно выполняют подготовку колонки 1, а именно: хроматографическую стеклянную колонку диаметром 1,2 см, высотой 30 см заполняют силикагелем, предварительно обработанным следующим образом: силикагель для колоночной хроматографии обрабатывают 0,5 н.раствором едкого натра путем настаивания в течение 12 ч. Затем промывают водой до нейтральной реакции (по Фенолфталеину), высушивают на воздухе и активируют при температуре 110 ОС в течение 12 ч. Навеску обработанного щелочью силикагеля в количестве 5 г суспендируют в 20 мл гексана и переносят в хроматографическую колонку. Для стабилизации колонки пропускают 100 мл гексана поддавлением. 2 мл раствора липидов вхлороформе наносят на подготовленную щелочную хроматографическую колонку и после поглощения раствораверхним слоем сорбента начинают раз деление липидов на фракции. Вначалеотделяют неэстерифицированные жирныекислоты от нейтральных липидов ифосфолипидов, пропуская через хроматографическую колонку этиловый эфирв количестве 200 мл, который элюирует нейтральные липиды и часть фосФолипидов. Затем через колонку пропускают метанол в количестве 100 мл,который освобождает неэстерифициро ванные жирные кислоты от фосфолипидов.Скорость элюирования составляет2-3 мл в мин под давлением. Полученные элюаты, содержащие нейтральные иполярные (фосфолипиды) липиды, объ единяют и растворители отгоняют подвакуумом. Остаток липидов перерастворяют в 2 мл гексана и подвергаютдальнейшему разделению на второйхроматографической колонке. 5 Неэстерифицированные жирные кислоты, адсорбировавшиеся на щелочномсиликагеле в виде солей, извлекаютс первой хроматографической колонкипутем промывания ее 120 мл 2 раст- ЗО,вора муравьиной кислоты в эфире.Затем растворитель отгоняют под вакуумом, остаток перерастворяют в минимальном количестве хлороформа(0,5 мл) и используют для дальнейшего анализа. Смесь нейтральных липидов и фосфолипидов, освобожденнуюот неэстерифицированных жирных кислот, подвергают дальнейшему фракционированию на второй хроматографической колонке. Подготовку второй хроматографической колонки осуществляютследующим образом: 5 г силикагелядля колоночной хроматографии активируют при 100 ОС в течение 12 ч,суспендируют в 20 мл гексана и 45 взвесь переносят в стеклянную хроматографическую колонку диаметром1,2 см, высотой 30 см. Хроматографическую колонку кондиционируют путемпропускания 100 мл гексана.5 О Смесь нейтральных липидов и фосфолипидов, растворенную в 2 мл гексана, полученную с первой хроматографической. колонки, наносят навторую хроматографическую колонку.После поглощения раствора липидовверхним слоем сорбента приступаютк элюированию фракций.Вначале колонку промывают 100 мл.смеси гексан-диэтиловцй эфир (98:2)под давлением так, чтобы скорость 6 О элюирования составляла 2-3 мл/мин,собирая первую фракцию на выходе изколонки. Вторую фракцию получают путем пропускания через хроматографическую колонку 120 мл смеси гексан диэтиловый эфир (90:10). Промывая824054 Формула изобретения 25 Составитель Ю. Алмазов Техрсд Н.Иайорош Корректор М, Коста Редактор А. Шандор Заказ 2099/64 Тираж 907 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная,4 колонку 120 мл смеси гексан-диэтиловый эфир, взятых в соотношении 80:20, получают третью Фракцию. Затем через хроматографическую колонку пропускают 120 мл диэтилового эфира, собирая четвертую Фракцию. В последнюю очередь колонку промывают 100 мл сме" си хлороформ-метанол (20:80) и получают пятую. фракцию.Все полученные элюаты поочередно концентрируют путем стгонки раствори теля под вакуумом и используют в дальнейшем анализе.Для идентификации полученных фракций, их чистоты и качества разделения используют метод тонкослойной хроматографии на закрепленном 15 слое силикагеля, испопьзуя стеклянные пластинки размером 9 х 12 см.Предлагаемый способ обеспечивает возможность повышения точности разделения липидов рыбьего жира на Фрак ции, что улучшает качество и чистоту получаемых фракций. Способ разделения липидов рыбьегожира на фракции путем нанесения его на силикагель с последующим элюиро"ванием фракций липидов органическимирастворителями о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, силикагель предварительно обрабатывают раствором щелочи,из нанесенного образца последовательно вначале этиловым эфиром, затемметанолом элюируют смесь нейтральныхлипидов и фосфолипидов, после чего2 раствором муравьиной кислоты в эфире элюируют неэстерифицированныежирные кислоты, далее смесь элюатовнейтральных липидов и фосфолипидовконцентрируют, помещают на силикагельсмесью гексана с диэтиловым эфиром,взятых в соотношении 98:2, элюируютФракцию эфиров стеринов,после-чеготеми же элюэнтами в соотношении 80 т 20элюируют холестерин и диглицериды,из оставшегося на силикагеле.адсорбата вначале диэтиловым эфиром вымывают моноглицериды, а затем смесью1 хлороформа и метанола в соотношении20:80 элюируют фракцию Фосфолипидов. Источники информации принятые во внимание при экспертизе 1 Кейтс М. Техника липидологии. М., 1975, с. 121-135.