Способ определения скорости лизисафибринового сгустка

Совэ Советских Социалистических РеслублнкОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Ж1(22) Заявлено 22.07.79 (21) 2798602/28-18 (51)м Кл с присоединением заявки Йо 6 01 й 33/86 ГосударствеииыЯ комитет СССР ио аеяам нзобретеииЯ и открытий(088.8) Дата опубликования описания 23. 04,81(72) Авторы изобретения В.П. Торчилин, Е.В. Ильина и Е.Г. Тищенко к медицице,биологически линдре мдним изреэ труборой принезначит дельзвест и, за егает льную Изобретение относитсяа именно к исследованию х объектов.Известен способ определения скорости лизиса фибринового сгустка путем инкубации его с раствором фибринолитического Фермента с последующим измерением оптической плотности инкубационной среды 11.Однако известный способ не обеспечивает высокой точности, чтобы нолучить достоверные результаты .необходимо провести большую серию анализов (10-20 опытов)Цель изобретения - повышение точ- .15 ности способа.Эта цель достигается тем, что фибриновый сгусток перед инкубацией помещают на проницаемую для белка подложку, затем располагают на по верхности раствора Фермента и процесс инкубации ведут при постоянном равномерном перемешивании раствора.Способ осуществляют следующим образом. 25В гладкостенном ци о ный сгусток готовят о и ных методов. Нижний с кае тянутый сеткой, к кот л сгусток, опускают на е 30 глубину в раствор Фибринолитического Фермента, находящегося в реакционном сосуде, Содержимое сосуда перемешивают со скоростью, достаточной для равномерного распределения прбдуктов деградации по всему объему раствора. По мере лизиса сгустка, который происходит только с нижней поверхности, верхние слои сгустка опускаются, прижимаются к сетке и в свою очередь, претерпевают.лизис. Отбор проб и определение концентрации продуктов деградации производят обычным способом.Благодаря условиям осуществления способа белок поступает в раствор равномерно и концентрация раствора является истинным показателем скорости ливиса сгустка. достаточно одного, в крайнем случае двух опытов, чтобы получить точные данные.П р и м е р 1. Приготовление растворов. Фибриноген растворяют в 0,1 н. Фосфатном буфере рН 7,4, в котором содержйтся 0,02 М ЭДТАа. Концентрация фибриногена 12 мг/мл.Тромбин растворяют в 0,1 н,фосфатном буфере рН 7,4 так, чтобы кон центрация его составила 500 ед/мп.824053 Время,прошед"шее отначалалиэисадо данного измерения,мин Оптическая плотнооть% Плнстрастворениясгустка,Ъ изменение. (в зависимости от лизиса тромба) Контрольно- образцаго образца с тромбом 0,481 0,487 0,487 0,488.0,481 0 0,012 0,030 0,060 0,499 О, 517 0,548 30 12 45 24 Химотрипсин растворяют в 0,1 н. фосфатном буфере рВ 7,4.Концентрация 0,25 мг/мя. Начальную оптическую плотность замеряют на спектрофотометре при длине волны 280 нм.Получение Фибринового сгустка.5 Перед внесением растворов Фнбриногена и тромбина в трубку, нижний срез которой затянут сеткой, последнюю с внешней стороны затягивают пленкой0,5 мл раствора Фибриногена в ф 0,1 мл раствора тромбина вносят последовательно на сетку при помощи дозирующих микропипеток, быстро перемешивают тонкой стеклянной палочкой и полученную массу выдерживают при 15 комнатной температуре в течение 1 ч. Затем с сетки удаляют пленку и трубку с образовавшимся сгустком помещают в стаканчик с 20 мг раствора Фермента на глубину 2-5 мм. Раствор Фермен О та перемешивают при помощи магнитной мешалки со скоростью 150 об/мин. За скоростью лизиса Фибринового сгустка следят по изменению увеличению) оптической плотности при длине волны 280 нм во времени.При проведении эксперимента берут два параллельных образца с тромбами и одну контрольную пробу.Контрольная проба - изменение оптической плотности раствора Фермента ЗО беэ Фибринового сгустка, так как у раствора фермента в результате авто- лиза со временем происходит измене-. ние оптической плотности.При проведении эксперимента за полняют таблицу, строят график приращения оптической плотности от времени и определяют сд сС.В таблице приведены изменения оптической плотности в зависимости от 40времени.За .100 принимают оптическую плот-" ность при полном растворении сгустка,фиксируемое при этом время, это время полного растворения сгустка и оно служит величиной сравнения между 45 образцами. По данным таблицы строят график, приведенный на чертеже.По оси абсцисс отложено время в мин, а по оси ординат-приращение оптической плотности в Ъ при длине волны 280 нм. Сд С, определяют построением графика и уточняют методом наименьших квадратов. Примеру 1 соответствует прямая 1 на чертеже, Сд угла наклона прямой равен 0,60.,П р и м е р 2. Этот пример про,водят, в тех же условиях, что и пример 1, однако концентрация фибриногена в сгустке 7 мг/мл. Концеитраци; химотрипсина та же, что и в примере 1 и составляет 0,25 мг/мл. Примеру соответствует линия 2 на чертеже, где сд угла наклона равен 0,74.П р и м е р 3. Условия те же, что и в примере 1. Концентрация фибриногена в сгустке 7 мг/мл. Концентрация химотрипсина 0,125 мг/мл. Примеру соответствует прямая 3 с сд угла наклона 0,44.П р и м е р 4. Условия и концентрация реагентов те же, что и в примере 1. Опыт проводят через месяц после проведения примера 1. Примерутакже соответствует прямая 1 с сд угла наклона 0,61.Иэ приведенного графика видно, то сд угла наклона прямой характеризует скорость растворения фибринового сгустка, причем с увеличением скорости увеличивается сд угла наклона.С увеличением концентрации фибриногена плотность Фибринового сгуста возрастает, скорость растворения уменьшается, а следовательно, уменьшается са угла наклона прямой.С увеличением концентрации фермента,лиэирующего сгусток, скорость лизиса увеличивается.Предлагаемый способ быстро и с большой точностью позволяет определить скорость лиэиса фибринового сгустка, а в известном способе для получения результата необходимо 10-20 опытов.) Плотность растворения сгустка,% Время,прошедшее отначалализисадо данного измерения,мин Оптическая плотность, % образцас тромбом контрольного образца изменени в завис мости от ливиса тромба) 0,491 0,592 0,101 60 41 90 0,495 120 0,495 150 0,500 180 0,505 200 0,508 0,627 0,131 0,693 0,198 0,730 0,230 0,754 0,249 53 80 100 100 0,757 0,249 через 1 месяц 0 0,481 0,487 0,497 0,488 15 30 45 29 0,491 46 60 58 0,495 0,495 0,500 0,505 0,512 90 120 83 150 97 100-180 100 210 Формула изобретения Способ определения скорости лизиса фибринового сгустка путем инкубации его с раствором фибринолитического фермента с последующим измерением оптической плотности инкубационной среды, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения .точности способа, фибриновый сгусток перед инкубацией помещают на прони 0,481 0 0,506 0,019 0,517 0,038 0,5560,668 0,600 0,109 0,631 0,136 0,692 0,197 0,730 0,230 0,741 0,236 0,748 0,236 цаемую для белка подложку, затемрасполагают на поверхности раствора 45 фермента и процесс инкубации ведутпри постоянном равномерном перемешивании раствора. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Са 1 Спеу Р.5. апд ЫЬ йаЬег АМТЬговЬов 1 в Вел. 1979, чо 1, 14,р. 85-94.824053 Э 7 Ю,ми а за оставител ехред Н.иа. Малютинарош Коррект нова щп ПЙП "Патент", Г. Уагород, ул. ПроеКтная,4 Ти НИИПИ Го по дел 35, Моск