Способ диагностики альвеококкоза

(23) Приоритет Государственный комитет СССР по дедам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Н. Е, Баллад, М. В. Далин и Е. А, Коврова Ордена Трудового Красного Знамени институт медицинскойпаразитологии и тропической медицины им, Е,И, Марциновского(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЬВЕОКОККОЗА Изобретение относится к областимедицине, а именно диагностике паразитарных заболеваний.Известен способ диагностики альвеококкоза путем сенсибилиэации эритроцитов антигеном, сведения их с испытуемой сывороткой с последующимучетом результатов их взаимодейтсвия,Однако известный способ не обес Опечивает высокой чувствительности испецифичности диагностики,Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности диагностики,15Это достигается тем, что эритроциты сенсибилизируют очищенным антигеном с молекулярным весом выше600000, выделенным из альвеококка, ипри положительной реакции в титре160 и выше диагностируют альвеококкоэ.Способ осуществляют следующим об.разом,Цельный экстракт гомогенизироватных ларвоцист альвеококка, выделенных от хлопковых крыс, наносят вячейку с мембранным фильтром маркиХМ 100 для отеделения и концентрирования фракции с молекулярным весом выше 100000 от веществ с меньшим молекулярным весом. Фракцию с молекулярным весом выше 100000, составляющую 80,2 белка цельного экстракта для дальнейшего разделения и концентрации диагностически ценных антигенов альвеококка,наносят затем на ячейку с мембраной марки ХМ 300. Фильтрация через мембрану позволяет получить в концентрате фракцию с молекулярным весом выше 300000, содержащую 28,2 белка цельного экстракта ларвоцист, включающую основные дйагностически ценные антигены паразита, антитела к которым имеются у большинства больных альвеококкоэом,Дпя последующей очистки фракции оз белков хозяина ее наносят на колонку с сефарозой 4 В. Разделение ведут в 0,53 НаСС при скорости элюции 2,5 мп/чсм, Пробы собирают на автомаг.тический коллектор по 3 мл, По данным иммунохимического анализа элюат делят на 4 подфракции.Две из них (91,2)содержат по одному антигену паразита,очищенному по данным реакции двойной диффузии в геле (РДДГ),от бел ков хозяина.В состав третьей подфракции входит 4 антнгена паразита и 2антигена хозяина. Четвертая подфракция,входящая во внутреннем объеме колонки,представляет собой смесь антигенов паразита и хозяина с преимущественнымсодержанием последних, Первые трифракции содержат соответственноЪ:2 е 3,51; 8,5 белка фракции концентрата ХИ 300, что составляет 0,58; 1,01;2,4 всего исхоцного белка цельногоэкстракта, в то время как в состав чечетвертой подфракции входит Йб Ъ белка фракции или 24,2 Ъ цельного экстракта,что свидетельствует о значительнойочистке трех первых подфракций и невысоком процентном содержании отдельныхактивных антигенов альвеококка в исходном материале.Проведение реакции непрямой гемагглютинации с очищенными антигенамиальвеококка,Перед танизацией консервированныеФОрмалинОм эритроциты Отмывают трираза (два раза физиологическим раствором и один раз буфером рН 7, 2 при2,5 т об/мин 3-5 мин) .Состав буфера, мп: 0,15 К)4 агНЭР 04 72; 0,15 М КНР 04 28;0,9 ИаСХ 900,Затем к 2,5 суспензии эритроцитов вливают 1:1 раствор танина в бу -фере (1:20000) и полученную смесьинкубируют в термостате 20 мин при37 С, После этого эритроциты отмываются три,раза буфером при 2 тоб/мин 3-5 мин и ресуспендируют в2,5 концентрации в буфере.Лиофилизированный порошок антигенов альвеококка растворяют в буфередо концентрации белка, мг/мл: в 1фракции 004 во 11 фракции 0,19;в 111 фракции 0,.17,Танизированные эритроциты соединяют с равными объемами антигенов иполученные смеси оставляют на 20 минв термостате и 40 мин при комнатнойтемпературе, Затем эритроциты,сенсибилизированные антигеном (диагностикуьы), отмывают 3 раза, ресуспендируют в превоначальном объеме(2,5 суспензия), консервируют мертиолатом (1 10.000 конечная концентра ция) и оставляют в холодильнике доследующего дня,Приготовление сывороток для реакции,Все сыворотки (испытуемые, положи -тельная контрольная сыворотка и нормальная кроличья, на которой ставятреакцию, т, е. раз водящая) ин активируют, т,е, выдерживают 30 мин в водяной бане при 56 С, После инактивации сыворотки адсорбируют; к 1 мл сыворотки добавляют 0,2 мл отмытых консервированных эритроцитов и выдерживают не менее двух часов, Перед постановкой реакции норман .:., и кроличьюсыворотку разводят 10",;" на нейготовят последовательно двукратные разведения испытуемых сывороток иконтрольной положительной, начиная с1/20 и кончая 1/40.960 (12 разведемний) . Реакцию проводят в аглютинационных досках,5 для испытания сыворотки с тремядиагностикумами (1, 11 и 111 фракции)готовят четыре ряда (по 0,25 мл в каждой лунке) последовательных двукратных разведений, В первые три ряда1 О закапывают диагностикумы по две капли в каждое разведение сыворотки, ав четвертый ряд - танизированныеэритроциты (контроль сыворотки), Необходим также контроль диагностикумов:5 испытание их с разведениями заведомо. положительной сыворотки и больногоальвеококкозом, и с разводящей сывороткой (3-4 лунки).Реакцию в зависимости от ее интен 20 сивности оценивают по четырехплюсовой системе;- компактный кле -точный агрегат;- ровный слойклеток со складчатыми краями на днелунки;- ровный слой клеток, края25местами зазубренные; + - темное узкоекольцо окружает края слоя клеток;+- - толстое темное кольцо окружаеткрая слоя клеток, покрывающего малуюповерхность; - плотный круглый осадокклеток, так называемаяпуговка ,За положительный результат принималиположительную реакцию не менее, чемна три креста с титром .сыворотки.160, принятом за диагностический,Определение сравнительной активности диагностикумов из очищенных антигенов альвеококка и из цельного антигена эхинококка (жидкости ларвоцист)показало преимущество для диагностики гомологичных антигенов (табл,1),40 Положительная реакция в диагностическом титре и выше наблюдалась сдиагностикумом из 1 фракции у 88,8сывороток больных альвеококкозом, иэ11 фракции - с 88,6 сывороток больных, из 111 фракции - с 92,3, вто время как с диагностикумом изцельного антигена эхинококка реакциябыла положительна всего лишь с 80,9сывороток больных альвеококкозом50 (табл . 1) . Вариабельность иммунногоответа при данном гельминтозе требу .ет использования в диагностике исоответствующего набора антигенов,Поэтому одновременное использование55 трех очищенных антигенов позволяетеще больше повысить чувствительностьреакции, так как сыворотки больныхальвеококкозом, давшие отрицательныйрезультат с одними антигенами, былиположительны с другими,бОСравнительные анализы активностиРНГА с очищенными антигенами альвеококка и цельным антигеном (жидкостьларвоцист) .эхинококка приведены втабл. 1 и 2,766583 Таблица 1,и В тельдиаг" еском и вы 1 Фракци 5 88 0,19 31 (88 е 6 12 (92, 3 КЦ 1 Фракя ельныйнтигенхинокок 0,0,9) б л траелка нсиАнтиг и 1 фракция11 фракция111 фракци 1(100 0,19 100) 1(100) Цельный антигенэхинококк 2 (96) 0 оляет вы льных на не дает тов. ить аи ла изобретения иваетци ФИчди агнос раж 673 писное тент, г. ужгород, ул. Проектная,ППП ил Испытание. очищенных антигенов альвеококка с контрольными сыворотками, полученными от больных другими забо.Леваниями, показало в РНГА более высокую специфичность их по сравнению с цельным антигеном эхинококка. Ни одна из контрольных сывороток не давала положительного результата ни с одним из гомологичных антигенов (специфичность 100), в то время как антиген эхинококка имел специфичность 96 (табл,2), Высокая специфичность фракций позволила установить более низкий диагностический титр (160), по по сравнению с диагностическим титром (320), принятом.при исследовании сывороток в РИГА с антигеном эхинококка.Предлагаемый способ обеспечвысокую чувствительность н спеность, увеличивает надежностьВНИИПИЗаказ 7036/2 тики альвеококкоэа, поэболее высокий процент боней стадии заболеванияноположительных результ Способ диагностики альвеококкоэа путем сенсибилиэации эритроцитов антигеном, сведения их с испытуемой сывороткой с последующим учетом результатов их взаимодействия, о т л ич аю щи й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и специ" Фичности диагностики, эритроциты сен- Мсибилизируют очищенным антигеном с молекулярным несом выше 600000, выделенным из альввококка,и при положительной реакции в титре 160 и вьаае диагностируют альвеококкоз.