Способ получения водорастворимых антигенов

О и Й-С А сссУ 369 УУ Союз Советских Социалистических Реслублик(45) Дата опубликования описавия 30,05.80(51) М Кл г А 6 К 35 с 34 Государствеиинй комитет ссср ло делан иаооретеиий и открытий(72) Авторы изобретения А, М. Борисова, В. Я. Арион и С. Н. Москвина Второй Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ АНТИГЕНОВИзобретение относится ж области медицины, а именно к получению препарата антигенов миокардакоторые могут быть исспользосваны св диасгностичеаких целях для выявления, например, активности ревматическото,процесса:и уточнения 1 значения аутоиммунных механизмов в развитии ревматизма.Известен апюооб получения водораспворимых антигенов из гкани миокарда спутем ее гомогенизапсии с последующим центрифугированием гомогената и:выделением целевого спродукта.Однако изсвеатный апособ не гарантирует высокую иммунологичесскую актисвность и чу 1 вствительность антигенов,Целью изобретения является сповышение иммунолопичеакой а.ктивности и чувсгвительности антигенов,Это достигается тем, что ткань гомосгенизируют прси 13000 - 17000 обlмин в лриссугствии О,ОЗ - О,О 5 М Тсрис НС буфера ,при рН 7,8 - 8,2, спомогенат центрифугируют ступенчато от ЗООО до 39000 обмин, полученный осадок ресуспендируют, обрабатывают папа 1 ином спри аоотношении етю к субсграту 1: 10 - 5 и выделяют,целевой иродукт хроматографически,Кроме того, обработку птапаином проводят в течение 60 - 80 мин. А для,ресуапендирования осадка и хроматографии исполь.зуют О,ОЗ - 0,05 М Трис НС 1 буфер.Способ осущеспвляют следующим обра.зом.Сердечную тскань,полученную от здоровых лжец, погибших от случайных травм и азятую,не,позднее 4 - 6 ч после смерти, от смывают от еорэви, отделяют миокард и го.могенизируютв висревсм смесите,те в 0,03 - 10 0,05 М Трис НС 1 буфере (рН 7,8 - 8,2)1 - ,5 лсин при 13000 - 2 ОООО обlлсин. Подученную:массу затем подвергают дробному центрифугиросванию при числе оборотоэ от 3000 до 39000,в ьгинуту, Полученные в "ре зультате дробнопо центрифугирования клеточные мемсбраны сресуапендируют св том гке объеме буфера и перевсодят антиген в растворимое аосстояние обработкой паспаином при соотношении фермент: белок клеточных 20 мембран =.1: 5 - 1: 25, Инкубацию с ферментом проводят 1 ч ори 37 С. Добавлясот водацетат натрия до конечной концентра.ции 0,05 М для инактсевации действия 1 чалаина. Реасвщионную смесь центрифугируют 25 1 ч лсри 37000 обмин. Суспернатант собира.ют, концентрируют и нано 1 сят на хсроматографичеакую,колонку с сефадексом Сс - 200 (2,5 Х ЮО). О пищенный препарат собираюТ по 10 лтл.,Всего былю собрано 56 спроб. ГельЗО фильтрация позволяет разделить материал5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 на три фраации: А - с молекулярной массой не менее 2 ООООО Дальтон (пробирки 5 - 15); Б - , с молекулярной массой 1 ООООО - 35000 Дальтон (пробирки 17 - 35), Вфраюция - материал с молекулярной массой менее 35 ООО Дальтон (пробирки 37 - 56). Все трн фракции 1 концентрируют ультрафильтрацией,на мемранных фильтрах, Существенно 1 важным для способа являепся выбор соотношения,папаин: белок клеточных мембран.Наилучшие результаты лолучены лри соотношении,фермента к субстрату 1: 15 - 1:20 и температура реаиции 37 С, В этом случае раствррдмый антигенный материал обладает наиболышей активнастью и почти целиком обнаруживается во фракции Б.Очищенный,материал фраиции Б,позволяет диагностировать скрыто- и вялотекущие ревматичежие процессы (ревматизм 1 степени активности). Для выявления акти(вного,ревматического процесса требуется всего юдна единица продукта, в тю время, как в известном способе необходимо не менее 20 единиц антигенноло ыатериала.Способ поясняется следующими примерами.П р и м ер 1. Измельченную ножницами яа холоде (от +1 до +,2 С) ткань миокарда гомогенизируют 1,5 мин при 13000 обмин в 0,03 - 005 М Транс НС 1 буфера при рН 7,8 - 8,2, Гомогенат центрифугируют 1 О мин при 3000 обмин, супернатант собнрают и центрифугируют 1,5 ч при 39000 обмин (1 О 5000 д) на 1 препаративной ультрацентрифуге,Оса 1 дак (клеточные мембраны) рвсуспендируют;в там же буфере и обрабатывают папаином,при соотношении фермента к субстрату 1;25. Ивкубацию с ферментом проводят 1 ч при ЗГС. Добавляют иодацатат натрия до конечной;концентрации 0,05 М для инактлвации действия папаина, Реакционную смесь снова центрифугируют 1 ч при 37000 об/мин (88700 д) в юм же ро.торе. Супернатант собирают для дальнейшей очистки хроматографией на,колонке с сефадекоом б - 2 ОО (2,5 Х 1 ОО см). Пробы собирают по 10 мл. Всего собрано 56 проб.Полученные фраиции клеточных мембран миокарда концен"црируют с помощью ультрафиль"пров на аппарате фирмы Аппсоп 1 олландия.Антигенную актввность полученных клеточных мамбран миокарда апредечяют,во зсех 56 пробирках с,помощью реакции торможения миграции лелкоцитов как у больных с клинически выраженным ревматическим лроцеосом (11 степень активности), так и у больных с минимальной активностью реаматизма (1 степень активности), с неактивной фазой ревматизма и в контрольной,группе, При оценке антигенной активности полученных,клеточных мембран миокарда берут различные концентрации антнгена с.содержанием от 1:мкг до 150 мкд белка. Причем, у одного больного одновременно изучают все фракции, т. е, антигены берут из- разных пробирок соопветственно фракциям. В качестве контрольных антигенов используют фраиционированные анти- гены печеночной ткани, экстракты почечной ткани, синэвиальной ткани, скелетной мышцы, а также водно-соловые экстракты сердечной "пкани.Антигенная активность выявлялась в пробирках,за номерами от 5 до 35 включительна, а в пробирках от 36-й до 56-й не выявлялось присутствие антигена. Причем, для выявления активного ревматического процесса у больных с клинически ярко выраженной активностью необходимо было брать не менее 1 О - 15 мкг белка из пробирок с 5-й по,15-ую и 1 - 2 мкг беляка .из пробирок 17 - 35. Для выявления же активного процесса у больных с минимальной степенью актввности необходимо было брать 25- 50 мкг белка из пробирок 5 - 15 и 3 - 5 мкг белна из пробирок с 17 по 35.Таким образам, активными в антигенном отношении оказались фракции А (пробирки 5 - ,15) и Б (пробирки 17 - 35). Фракция В оказалась неактивной, т. е. состоящей из балластных белкав и не содвржащей антигеннапо материала. Самой активной фракцией оказалась Б фракция. Для выявления даже минимальной актввности ревматизма необходимо всего 3 - б мкг белКа этой фракции, тогда,как фракция Апо-,видимому, загрязнена другими белками мембран и:поэтому в реакцию необходимо брать большее иоличество,материала (25 - 50 мкг белка).П р им е р 2. Все 1 процедуры проделы- вают, как:в примере 1, но соотношение фермента папаина к белку клеточных мембран берут 1: 5,Антигенная актнвность клеточных мембран миокарда обнаруживалась как во фракции А, так и во фракции Б, но только у больных с .ярко выраженной актввностью ревматического процесса. У больных с минимальной актввностью ревматическогопроцесса работала толыко фраиция Б, но с болвшей концентрацией антигена, чем в примере 1 (10 - 15 люкг).Таким образом, при соотношении фермента папаина .к белку,клеточных мембран 1: 5,происходит разрушение ферментом активното материала, следовательно, в даннсм случае было взято фермента,в избытке и часть антигенов разрушиласьпоэтому выход антигенного материала оказался небольшим.П р и м е р 3. Все процедуры получения водорастваримых антигенов миокарда проводятся, как в первых двух приыерах, но соотношениефермента папаина к белку,клеточных, мембран берут 1; 15.При данных условиях выделения анти- генов миакарда антигенная активность наи-.736977 Формула изобретения Составитель С. МалютинаТехред А. Камышникова Корректор И, Осиновскаи Редактор Г. Прусова Заказ 575/713 Изд.309 Тираж 649 ПодписноеНПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, )К, Раушская наб., д. 4/5 Тип. Харьк. фпл. пред, Патент более выражена во фракции Б клеточных мембран миокарда. Меньшая активность антигена отмечена во фракции А, фракция В - неактивна. У больных с минимальной степенью актввности (1 степень) для выявления ревматического процесса дсстаточно было антигена клеточных мембран миокарда с концентрацией белка из фракции А от 2 мкг .до 10 якг, а в Б фракции всего 1 - 2 лкг белка. У больных с выраженным 10 ревматичеаким працессом (11 степень актив. ности) для диагнвствии достаточно было 1 лжг антигена фракции А, а фракции Б - 1 мкг и менее,Исходя из вышеописанных,данных весь 15 материал, полученный после очистки на сефадеисе б - 200 объединяют в три фракции: фракция А с порядковым номером лробирок от 5 до 15 включительно, фракция Б - пробирки с порядковыми номерами от 20 17 до 35 включительно, и фракция В - лро. бирки с порядковыми номерами от 37 до 56.Полученные во 1 дорастворимые фракции клеточных мембран миакарда исследовали в реак 1 ции торможения,миграции лейкоци тов у 300 человек, из которых 150 были больны ревматизмом, 150 восставляли контрольную прулпу. В ,контрольной группе торможение миграции лейкоцитов на анти- гены клеточных мембран миокарда не от. 30 мечалось. Индекс миграции лейкоцитов у здоровых лиц составлял не менее 96%. У остальных лиц контрольной группы (людей с другыми заболеваниями) средняя величина индекса миграции лейкоцитов была 35 также выше 80% (от 91 до 136%)У больных активным ревматизмом отмечалось отчетливое торможение миграции лейкоцитов, оно было гораздо более выраженным, чем при использовании водно-со левых экстрактов миокарда. Средняя вели. чина индекса миграции лейкоцитов у больных актлвным ревматизмом при использовании одинаковых концентраций антигенов, но разных фракций дает следующие результаты: фракция А составляла 35 - 49%, фракция Б - 20 - 33%, а фракция В - .94 - И 2%. Следовательно, наибольшее торможение миграции лейкецитав, т. е. наилучший результат, дают антигены, взятые из фракции Б.Предлагаемый способ гарантирует высокую иммунологичеакую активность и чувспвительность антигенав, что позволяет улучшить диагностику заболевания, а также возможность обнаружения скрытых и вялотекущих форм сердечных заболеваний. 1. Способ получения водорастворимых антигенэв из ткани миокарда, путем ее гомогенизацни с последующим центрифугиро. ванадием гомогената и выделением целевого продукта, отл ич а ющи йс я тем, что, с целью повышения иммунологической активности и чувст 1 вительности антигенов, ткань гомогенизируют цри 13000 - 17000 об,яин в присупспвии 0,03 - О,О 5 М Трис НС 1 буфера при рН 7,8 - 8,2, гомогенат центрифугируют ступенчато от 3000 до 39000 облин, атолученный осадок ресуспендируют, обрабатывают папаином лри соотношении его к субстрату 1: 10 - 15 и выделяют целевой продукт хроматографичеаки.2, Спогоб по,п. 1, отл,и ч а ю щи й с я тем, что обработку палаином проводят в течеоие 60 - 80 мин.3. Способ по п, 1, о т л,и ч а ю щ и й с я тем, что,для;ресуапендирования осадка и хроматографии используют 0,03 - 0,05 М Транс НС 1 буфер.