Способ получения межвидовых гибридных форм картофеля

О П И С А Н И Е 19 З 4ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 0901,79 (21 2710489/30-15с присоединением заявки Мо(23) ПриоритетОпубликовано О.105.80., Бюллетень Й 9 17Дата опубликования описанию 0505,80 А 01 Н 1/04 Государственный комитет СССР ио дедам изобретений н открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЖВИДОВЬЕ ГИБРИДНЫХ ФОРМ КАРТОФЕЛЯ Способ осуществляют следующим об"разом.2 О Свежеиэолированные в стерильныхусловиях с помощью 3,5-4,0 раствора фермента ксиланазаф протопласты из культуры ткани одного вида картофеля, например Яо 1 апцв сцЬего дшп 1 ., сорта Приекульакий ранний(2 п х = 48) и с помощью 2,0-2,5 раствора того же фермента протопласты иэ мезофилла листа другого вида картофеля, например Яо 1 апшп сЛасоег- щ зе В 1 сс, (2 п = 2 х = 24) в 0,3-0,4 М Однако использование для селекции гибридных клеток среды без гормональных добавок перспективно для отбора тех комбинаций, которые характЕриэуются способностью к опухолеобразованию., что значительно сужает рамки получения соматических гибридов у других сельскохозяйственных раотений, в частности картофеля, так как не обнаружена до настоящего временИ гормонеэависимость. При Изобретение относится к селекции сельскохозяйственных растений, в частности картофеля.Известны способы гибридизации соматических клеток, при которых для смешения изолированных протопластов используют различные культуральные среды, например, Линсмайера иСкуга 1).Однако применение этих сред не дает возможность получать растения картофеля.Известен также способ, при котором получают соматические гибриды между Н 1 сос 1 апа д 1 аиса и Юсо 11 апа 1 апдвс 1 огй 11 путем использования простой сахароэно-минеральной среды без добавления экэогенных факторов. этом можно повторить только то, чтоуже получено половым путем.Целью настоящего изобретения является устранение барьера несовместимости и ускорение получения межвидовых гибридных Форм картофеля.Цель достигается тем, что слияние протопластов производят с помощью полиэтиленгликоля с молекулярным весом 1500-2000 в концентрации40-50; для отбора гибридного продукта используют модифицированнуюсреду Мурасиге и Скуга, применяютдвухступенчатую систему индукции 15 марфогенеэа и технику 1 фткани-нянькин.растворе О-маннита смешивают в соотношении 1: 1.Суспенэию изолированных протопластов приведенных видов картофеляосаждают центрифугированием (70110 д в течение 3-4 мин) и ресуспендируют с помощью 0,16-0,17 М раствора Са(ИО) до плотности 810-110 прот/мл.В стерильных условиях, например вмикробиологических боксах, помещают3-4 капли смешанной суспенэии изолиЪрованных протопластов двух видовкартофеля на гладкое стекло, например.покровное стекло. Для уменьшения испарения покровное стекло предварительно помещают в закрытую посуду, например чашки Петри (60 11 мм).Через 3-5 мин (когда протопластыосядут) осторожно по краям добавляем 8-11 капель 40-50-ного раствораполиэтиленгликоля с молекулярным весом 1500-2000.По истечении 15-25 мин культивирования полиэтиленгликоль удаляют спомощью остроконечной пипетки, на-,пример пастеровской пипетки, и суспензию осторожно промывают 1-2 раза0,16-0,17 М раствором Са(ИО) и1-2 раза жидкой культивационной средой, например Мурасиге-Скуга.Отмытую суспензию протопластовзаливают теплой модифицированнойкультивационной средой, напримерМурасиге-Скуга (макромикросоли,Ре - хелат - по М-С, В - 2,0 мг/лВ 6 - 0,8 мг/л, 2,4 Д - 1,0 мг/л,А - нафтилуксусная кислота (НУК)1,0 мг/л, б - бенэиламинопурин(БАП) - 1,0 мг/л, сахароза - 25 г/л,маннит - 0,32 М бактоагар Шйсо0,4-0,6, рН 5,4-5,7.Посуду заклеивают пленкой, Йапример парафином, инкубируют во влажной камере при 24-26 С и 16-18-часовом фотопериоде (500-700 лк).Схема селективного отбора гибридных продуктов основана на отсутствии 45деления клеток одного из партнеров, например Я.сйасоепзе, и подавлении морфогенеза у другого партнера, например Я.1 цЬегозцт.Во время инкубирования слившиесягибридные протопласты образуют клеточную стенку и в ходе делений дедифференцируются.Полученную через 2-3 недели каллусную ткань величиной около 1 ммвместе с блоками агаровой среды10 Х 5 мм вырезают и высаживают нату ж.среду, но беэ д-маннита. Инкубируют их во влажной камере при24-26 С и 16-18-часовом фотопериодео1500-2000 лк 1-2 недели, бОСформировавшуюся каллусную тканькартофеля (размером 2-3 мм) пассажируют на среду для морфогенеэа (мине.ральная основа среди Мурасиге-Скуга;В( - 0,6 мг/л; мезоинозит - 100 мг/л; 65 БАП - 5,0 мг/л; НУК 1 мг/л; сахароза - 2,5 г/л, агар - 7 г/л; рН5,6-5,8).Для усиления процессов метаболиз -ма каллусной ткани применяют технику ткани-няньки. С этой цельюрядом с полученной тканью помещаюткусочки другой дифференцированнойткани картофеля, например сеянца9718 с/70 (Украинский НИИ картофельного хозяйства),После 1-2 недель культированиякаллуснуюткань переносят на ту жесреду, но с уменьшенным количествомгормональных добавок (БАП - 0,3 мг/л,НУК - 0,1 мг/л), где зачаточные стеблевые почки через 3-4 недели развиваются в стебельки.Таким образом, полученные побегикартофеля отделяют от каллусной ткани и переносят для укоренения на среду, разработанную в лаборатории оздоровления Украинского НИИ картофельного хозяйства.Размножают растения черенкованием 1 п ч 11 го и пересаживают в почву уже гибридные растения межвидового проис - хождения.Эффективность предлагаемого способа заключается в устранении барьера несовместимости между видами, в получении межвидовых гибридных форм сельсккфхозяйственных растений, в частности картофеля. Способ дает возможность получать гибридные комбинации, образование которых половым скрещиванием невозможно, а именно цибридные растения (имеют гибридную цитоплазму и ядро одного из партнеров), Кроме того, способ относительно простой и доступный, не нуждается в дорогостоящем и дефицитном оборудовании, ферментах и реактивах. Формула изобретенияlСпособ получения межвидовых гибридных форм картофеля, включающий слияние изолированных протопластов и культивирование их на питательных средах, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью устранения барьера несовместимости и ускорения получения межвидовых гибридных форм, изолированные протолласты перед слиянием обрабатывают раствором полиэтиленгликоля с молекулярным весом 1500- 2000 в концентрации 40-50 в течение 15-25 мин при комнатной температуре, после чего промывают один-два раза 0,16-0,17 М раствором азотнокислого кальция, а после слияния, культивируют на модифицированной среде Мурасиге-Скуга до образования каллуса, который пассажируют сначала на обогащенную фитогормонами среду Мурасиге-Скуга с применением техники ткани-няньки а затем на ту же среду, но с меньшим количеством731934,Составитель Л.Марченкова Техред Ж.Кастелевич Корректор М,Вигула Редактор О.Иванова Заказ 1578/2 Тираж 723 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 гормонов до появления гибридных побегов, которые пересаживают в почву и укореняют,Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. Ь 1 пвва 1 ег Е.М., Ясооп Г. Р 1 ап 1 РЬуядо 1 оду 18, 100-127, 19652. Патент США 9 3832801,кл. Д 016 31/00, 1965, (прототип 3,3. Остапенко Д.П Прокопчук Н.Г. плив складу поживного середовища яа роост рослин картопл 1 1 п ч 1 го. Сб. фКартоплярство, Киев, 1978, В. 9 (методика).