Способ получения антибиотика реумицина

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советскнк Социалистических Республик(11) 452237 АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ олнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 01,09,66 (21) 1100276/31 с присоединением заявки йо -(45) Дата опубликования описания 291) М. Кл. С 12 Р 9/ вв 1 нврвтввнныЪ ноянтвтСоната Мнннотров СССРнв даная нвобрвтвнвЯн отнрытнЯ 53) УД 615ына, В. Г ева, А. Д никова, Е тьева, М. ерсон, А.икьян, К.ательский Р. А. И. П. ева,А. Ст ук, П. ова и Г енсва, 3ашин, Н.айлова,езина, Тгельман,збург, Д йс,мина,Королева Кузовков Ф. ОпарышМ. Тайг,С. НичипоИ. Скоромн Авторыизобретени НМи Е. К. Бе Л. А. Шт ожев,Бычкова,К. Исаева) ЗаЯвитель Всесою Фило сследоинститут антибиотик ыя научи 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА РЕУМИЦИ мицелия бледно-ро - бесцветвуетжелатина ируется, мал не роста нет. ар. и 5 е- еет еого б опыт синх фер. ро кр те ме и олучения ру Ас 1. асеев. Изобретение относится к химикомацевтической промышленности.Способ получения антибиотика ре мицина в патентной литературе не о сан.Целью изобретения является получ ние антибиотика реумицина, обладающ го противоопухолевой активностью.для этого культуру ЛсМпопцсез гесса Ьт цпсма штамм та 5000-23 выращивают 10 на среде, содержащей источник азота, углерода и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости адсорбционными или экстракционными методами.Морфолого-культуральные признаки реумицина.Морфология: спороносцы прямые, споры овальные, собранные в цепочки. 20Культуральные признаки: на агаризованных синтетических средах (среда Гаузе 9 1, СРс глюкозой и другие) зрелая культура (8-12 дней роста) име" ет хорошо развитый воздушный мицелий 25эового цвета; субстратный мицелий отемоватого до темно-каштанового цвета. Среда приобретает окраску аналогичную цвету субстратного мицелия На агариэованной органической среде 30(кукурузная М 6) : воздушныйскудныЙ, цвет кремовый илизовыйт субстратный мицелийный, пигмент в среде отсутстФизиологические свойства:разжижается, молоко пептонизсахароза инвертнруется, крахгидролнзуется, на клетчаткеКультура Ас 1, вес 1 иэ Ьффитеиэшт. в 5000-23 хорошо использует различные источники углеводов: арабинозу, ксилозу, рамноэу, глюкозу, маннозу, галактозу, мальтоэу, раффинаэу,слабо лактозу; не потребляет маннит,сорбит и другие многоатомные спттрты.Антимикробные свойства: культуральная жидкость Ас 1. оес 1 аа,Ьфийййзшт, М 5000-23 практически не обладаантагонистическим действием в отношнии ряда граммположительных (СорааЧс,амтфецв, Васй, оцЫНаэ и др .),.граммотрнцательных (Роспспф. соЕ 1 и др.ки сл от оу ст ой чи вых (МцсоЬасо.е чье рМе( )бактерий и дрожжеподобных организмов(ссикИста аСЬтсапв и др, ) .Освоен процесс глубинн иоза реумицина в условиях нынтеров,Для и антибиотика реумиц "на культу щ ЬфОатеОЬ ыт еЕ 5000-23 выращивают на жидких питательных средах с различными источниками азотистого питания как органического (кукурузный экстракт, рыбная, соевая мука, пептон и др.), так и ми нерального происхождения (аммонийныйи нитратный . азот), и различными источниками углеводистого питания (глюкоза, крахмал, глицерин) в различных сочетаниях; рН среды 6,8-7,0.10Температура культивирования 26-28 С Основные ингредие"ты питательной среды потребляются к 40-64 ч Ферментации; этот период сопровождается максимальным накоплением мицелиальной массы. Противоопухолевая активность в культу- ральной жидкости появляется на 16 20 ч роста и достигает максимума к 64-90 ч.Контроль эа накоплением антибиотика в процессе ферментации производит" 20 ся с помощью метода Миамура, основанного на подавлении дегидразной активности опухолевых клеток или метода культуры ткани.Культуральная жидкость, обладающая х 5 способностью подавлять дегидраэную активность опухолевых клеток в разведенни 1:80, 1:160 удовлетворяет требованиям для выделения и очистки препарата.30Противоопухолевое вещество содержится в культуральной жидкости, главным образом, в растворенном состоянии. Контроль процесса выделения противоопухолевого вещества из культуральной 85 жидкости, а также оценка получения препаратов осуществляются биологическим способом в опытах на животных с привитыми опухолями. Для выделения антибиотика из культуральной жидкости 40 могут быть использованыа) адсорбция на активированном угле с последующей десорбцией ацетоном или другими органическими растворителями) б) экстракция не смешивающимися с водой 4 органическими растворителями : спиртом эфирами, хлорированными углеводородами, бутиловым спиртом, этилаце татом и др. в 1 адсорбцня ионообменными смолами и десорбция растворами Е)кислотИв концентратов, полученных первыми двумя (а, б) способами, противоопухолевое вещество осаждают избыткомпетролейного и диэтилового эфира, По-лученный таким образом препарат представляет собой аморфный порошок кремо.вого цвета, растворимый в воде, низших спиртах, диметилформамиде и нерастворимый в петролейном эфире.Противоопухолевое действие реумицина изучаютна моделях следующих перевиваемых опухолей животных опухольЭрлиха в плотной и асцитной формах,саркома 180 (С) в асцитной и плотной фоомах, саркома 37 (С) в асцитФной и плотной формах, лимфаденоз НК/лн лимфосаркома(ЛИО) млшей, карциносаркома Уокера н саркома 45 (С) крыс.П р и м е р 1. Зрелой (8-12-дневной) культурой Ас. гесИз Ь цоеиэ шт. 9 5000-23 с агаризованной среды СРс глюкозой засевают маточные колбы (Эрленмейера на 750 мл) с Ферментационной средой (125 мл) следующего состава (%): кукурузный экстракт 0,5 (по сухому весу), сернокислый аммоний 0,35 глюкоза 1,0, крахмал 1,5, натриЯ хлористый 0,5, кальций углекислый 0,5.Засеянную культуру выращивают на круговой качалке (скорость вращения 230- 240 об/мин) при температуре 26-28 С в течение 48 ч, Из маточных колб стерильной пипеткой отбирают мицелиальную массу и засевают партию посевных колб с той же средой, выращивают на качалке в течение 48 ч.В ферментеры (емкость 45 л) помещают ферментационную среду (25 л) вышеуказанного состава, стерилизацию которой проводят при 122-124 С в течение 35 мин. Затем эту среду засевают посевным мицелием (2 к объему среды).Процесс ферментации протекает 85- 90 ч при слабокислом (6,6) или нейтральном (6,8-7,0) значении рН и полнеем потреблении углеводов к 60-64 ч,Противоопухолевая (антидегидразная) активность появляется к 16-20 ч глубинного роста культуры и достигает максимума к 64-88 ч. Эа активную культуральную жидкость принимается такая, которая в разведении 1:80 способна подавлять дегидразную активность раковых клеток. По достижении максисума активности процесс ферментации заканчивается. Затем из культуральной жидкости выделяют и химически очищают биологически активное вещество. Для этого 18 л нативного раствора с рН 6,8-7,0 помещают в аппарат, снабженный мешалкой, и при непрерывном перемешивании проводят подкисление 10-ным раствором соляной кислоты до рН 3-2,5 (определяют по индикатору бромфенолу синему). Затем приливают в аппарат 6 л н-бутилового спирта, что составляет 30 от объема нативного раствора, и в течение 30 40 мин при непрерывном перемешивании проводят экстракцию активного вещества в бутанол. По истечении указанного времени мешалку выключают и оставляют жидкость расслаиваться. Через 3-4 ч сливают нижний слой (маточный раствор) а затем верхний ( 1 экстракт) - в бутыли.йаточннк засасывают в аппарат приУ ливают ,6 л бутаиола (20 от нативного раствора) и в течение 15-20 мин при непрерывном перемешивании проводят вто рую экстракцню. По окончании ее отключают мешалку, и после отстаивания в452237 Составитель Т. ГоловинаТехрад Н.Бабурка . Корректор М. Демчик Редктор Н, Спиридонова Заказ 3364/5 Тираж 541 Подпи сное ЦКИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушскал.ыаб., д. 4/5филиал ППП Патент, г. ужгород, ул. Проектная, 4 аппарате в течение 30-40 мин нижний слой сливают в трап, а верхний ( бутанольный экстракт) объединяют с бутанольным экстрактом и в течение ночи выдерживают в холодильнике; при этом происходит частичное расслаивание эмульсии. Часть прозрачного верхнего слоя отделяют, а стойкую эмульсию разрушают фильтрованием под вакуумом через слой ваты и фильтровальной бумагиПолучают 8-9 л эк стракт а темно-коричневого цвета, который упаривают под вакуумом до объема 15-20 мц, и добавлением 150-200 мл петролейного эфира (10-кратный объем) осаждают препарат. Осадок отфильтровывают, промывают вначале петролейным, а затем диэтиловым эфиром и высушивают при комнатной температуре в вакуум-экснкаторе до постоянного веса.3)Получают 2-3 г антибиотика, который представляет собой аморфный порошок светло-коричневого цвета, частично растворивший в воде. Его распределяют между водой и бутанолом. Из водного 26 раствора получают 0,8-1,5 г кремового порошка, хорошо растворимого н воде, низших спиртах, а также диметилформамиде; ограниченно растворимого в ацетоне, хлороформе, бензоле (как на хо лоде, так и при повышенной температуре); практически не растворимого в петролейном и диэтиловом эфирах. Препарат считывается активным, если он обладает антидегидразной активностью Зб в концентрации 1 мг/мл.П р и м е р 2. 19 л культуральной жидкости, полученной по способу, описанному в примере 1, после отделения мицелиальной массы (рН 6-7) перемешивают в течение 40-50 мин с 95 г активированного угля. Уголь отфильтровывают, проьивают 2-3 раза дистиллированной водой(300 мл) и высушивают на воздухе. Элюацию активного вещества проводят дважды десятикратным количеством ацетона (950 мл), Ацетоновые экстракты объединяют, упаривают в вакууме (10-20 мм рт.ст,) при температуре водяной бани 35-40 С и остаток в виде маслянистой массы темно-желтого цвета растворяют в 20 мп метилового спирта. Двухкратной экстракцией петролейным эфиром (2 раза по 20 мл) удаляют масла, а метанольный слой упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 10 мл смеси метилового и бутилового спиртов (1:1), и активное вещество осаждают 70 мл эфира. Маточный раствор (темно-желтого цвета) сливают декантацией, осадок хорсвао отжимают на фильтре Шотта, промывают эфиром и высушивают в вакуум-эксикаторе. Получают 0,7 л препарата в виде аморфного порсшка кремового цвета, соответствующего по свойствам препарату, полученному по примеру 1.Формула изобретенияСпособ получения антибиотика реумицина, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что культуруАс(еоюусез гас(ав Ь одеев штамм В 5000-23 выращивают на среде, содержащей источник азота, углерода и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости адсорбционными или экстракционньвя методами.