298131

О П И С А Н И Е 298131ИЗОБРЕТЕН ИЯ Сосз Советских Социалистических РеспубликК ПАТЕНТУ ависимый от патентаК С 12 д 9/ Заявлено 04 ЛУ.1968 ( 1229809/30-15) Приоритет 07.17.967,21865/67, ЯпонияОпубликовано 11 Л 1 Л 971, Бюллетень10Дата опубликования описания 8 Х.97 Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР615.779,931:6088.8) Авторыизобретен ИностранцыХамао Умезава, Томио ТакеучиМаза Хамада и Кендж(Япония)Иностранная фиЗаидан Ходжин Бисеибуцу Ка(Япония) ками,осироМаеда аявитель аку Кенкиу Каи ОЛУт 1 ЕНИЯ АНТИБИОТИКА КАЗУГАМИЦИН ПО Изобретение относится к способам получения антибиотиков путем культивирования гриба-продуцеита на жидкой питательной среде,содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в особенности к способамполучения казугамицина с использованием вкачестве продуцента гриба из рода Югерогпусез.Известен способ получения казугамицина вкультуре гриба-продуцента Яг. 1 азцдаепззАТСС 1574 и АТСС 575,Предлагается способ получения казугамици.на, включающий культивирование гриба-продуцента из рода Ягер 1 огпусез на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, глубинным методом, при котором в качестве представителя рода 5 гер 1 отпусез берут Яг. 1 азцдар 1 пцз, а культивирование ведут при температуре от 25 до 35 С.Яг. 1 азцдазрпцз выделен из образца почвы, взятой в Маруяма, Усада-Хо в префектуре Нагано в июне 1965 г. на глицерино-казенно-агаровую среду. Он получил лабораторныйномер МА 350-СЗ и обнаружил следующиеособенности.На глицериновом огаре Чапека выращивание при 27 С: бесцветная или слегка желтоватая культура. Обильный воздушный мицелийог белого до слабо коричнево-серого цвета серебряно-серый 3 1 е, по Соог Наггпопу Мапца 1, (СНМ)1. Растворимого пигмента нет или слегка желтоватый.На глюкозо-аспар агино-агаровой среде 5 Краинского, выращивание при 27 С: бесцветная культура. Обильный воздушный мицелий от белого до коричнево-серого цвета (темно-серый 5 й, по СНМ), Растворимого пигмента нет.10 На агаре с яблочнокислым кальцием, выращивание при 27 С: культура от бесцветного до светло-желтого или светло-оранжевого цвета. Белый воздушный мицелий. Растворимого пигмента нет или желтовато-оранжевый, 1 б лочнокислый кальций вокруг культуры ипогда растворен.В пептоновом растворе, содержащем%азотнокислого натрия, выращивание при 27 С; бесцветная культура с белым воздуш ным мицелием. Растворимого пигмента нетили слегка жыповатыи. Восстанавливает нитраты.На ломтике картофеля, выращивание при27 С: мицелий от бесцветного до светло-сине вато-серого или светло-серого цвета (пепельные 5 1 е, по СНМ). Растворимого пигмента нет.На крахмально-агаровой пластинке, выращивание при 27 С: культура бесцветная с ЗО обильным воздушным мицелием от белого досветло-серого или светло-коричнево-серогоцвета, Растворимого пигмента нет или светложелтоватый, Отсутствие гидролиза или слабыйгидролиз крахмала.На пищевом агарс, выращивание при 37 С:культура от бесцветной до светло-желтоватокоричневого цвета, хороший рост. Тонкий и белый воздушный мицелий, Растворимого пи.мента нет,На пищевом агаре, выращивание при 27 С:культура от бесцветной до желтовато-коричневого цвета с белым воздушным мицелием.Растворимого пигмента нет.На кровяном агаре (10 о/о человеческой крови) выращивание при 37 С; бесцветная культура без воздушного мицелия, Растворимогопигмента нет, Сильный гемолиз.На среде из коагулированной сыворотки(выращивание при 37 С): морщинистая, бесцветная культура, Воздушного мицелия ирастворимого пигмента нет. Коагулированнуюсыворотку не разжижает.На желатиновой среде (укол в твердую среду), выращивание при 20 С: культура от бесцветной до желтоватой. Скудный белый воздушный мицелий. Растворимого пигмента пет,Желатину разжижает.На молочном обрате, выращивание при37 С; культура от бесцветной до бледно-желтоватого или коричневого цвета. Воздушногомицелия и растворимого пигмента нет. Сильная коагуляция и пептонизация среды.На тирозиновом агаре, выращивание при27 С: культура бесцветная с воздушным мицелием от белого до светло-оливково-серого иликоричневато-серого цвета. Растворимого пигмента нет, реакция тирозиназы отсутствует.На целлюлозе (фильтровальная бумага),выращивание прн 27 С: слабая культура, нобез разложения бумаги.С использованием углеводов на основнойсреде Придгема-Готтлиба, выращивание и ри27 С: манноза, инозит, крахмал, декстрин, лактоза, глицерин, галактоза, глюкоза, фруктозаи мальтоза - хороший рост. С рамнозой, инулином, дульцитом и арабинозой роста нет.Ксилоза, вероятно, непригодна, Маннит, сорбит, салицин, рафиноза и сахароза дают различные результаты.Суммируя вышеуказанные характеристики,можно сделать вывод, что штамм МА 350.СЗотносится к стрептомицетам нехромогенноготипа. Нет образования завитков, но имеегсяспиральная структура.Поверхность спор в отличие от 51 г. 1 азцдаепз 1 з ворсистая. На различных средах культура от бесцветной до желтоватого цвета с воздушным мицелием от белого до коричневатосерого цвета. Растворимого пигмента иет илиесть слегка желтоватый, Гидролиз крахмалаотсутствует или слабый. Сильное протеолигическое действие на среду. Положительное восстановление нитратов.Среди известных видов стрептомицетовштамм напоминает Ь. а 1 Ьцз Ваксмана и Ген 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6 О 65 4рици (1948) (Ь. А, ЮаКзгпап, Тйе ас 11 погпусе 1 ез, о 1. 2), но отличается от него ворсистой поверхностью спор. Установлено, что штамм может давать, помимо казугамицина, аурестрицин и тиолутин аналогично 51 г. 1 азцдаепз 1 в. Однако 81 г. 1 азцдазр 1 пцз может быть ясно отличен от Ыг, азцдаепз 1 з по поверхности спор и по другим признакам,Получено 600 мкг/смз казугамицина на восьмой день ипкубации, когда штамм, выделенный из почвы, выращивали при 27 С в среде, состоящей из 3,0/о порошка мальтозы соевой муки (продукт Прорич фирмы Аджимото) 0,1 о/о КНРО, 0,1 Мд 304 УНЯЛО, 0,3 о/о МаС 1, 0,0007 Сц 50 7 НО, 0,0002 /о 2 п 804 5 НО, 0,5/, пептона, 0,35/о СаСО, и 0,08 соевого масла (рН 7,0), при взбалгывании в машине, делавшей 140 ходов/мия с амплитудой 8 см.Получено 3950 мкг/смз казугамицина, когда штамм при моноспоровой селекции выращивали таким же образом, как указано выше, в среде, состоящей из 5,0 о/о порошка соевой муки (продукт 83 - мясо фирмы Аджимото) и 4,0 о/, соевого масла (масло Ширашими - продукт фирмы Аджимото) (рН не регулируют). Считается, что путем надлежащей селекции из штамма можно получить штамм с высокой способностью образования казугамицина.П ример 1. Среду, состоящую из 4,0/о мальтозы, 3,0 о/о соевой муки (продукт Прорич фирмы Аджимото), 0,1/, К,НРО, 0,1/о Мд 804 Н,О; 0,3 ХаС 1, 0,0007/о Сц 80 7 Н,О, 0,0012 пЯО, 0,0008/о МпС 1 7 Н,О, 0,0002 /о 2 п 80 5 НО, 0,05% пепгона (полипептон фирмы Дай го Сейяку), 0,35 о/о СаСОэ и 0,08 соевого масла, разли. вают по 125 мл в колбы емкостью 500 мл, рН доводят до 7,4 и автоклавируют 20 мин при температуре 120 С. Эту стерилизованную в автоклаве среду инокулируют чистым штаммом с помощью платиновой петли и культивируют во взбалтывающей машине при температуре 27 С в течение пяти дней. На пятый день рН достигает 7,6.Культуральную жидкость фильтруют для отделения массы мицелия, в фильтрат добавляют 1 н. НС 1 для осаждения нерастворимых веществ при рН 5,0. Затем фильт 1 Уат фильтруют, и получают 450 мл прозрачного раствора, в котором содержится 360 мг казугамипина, Фильтрат пропускают через колонку диаметром 1,2 см, заполненную кислотной ионообменной смолой (амберлит ХЕ) аммиачного типа, Казугамицин, адсорбированный смолой, вымывают 0,5 и. аммиаком. Активный элюат содержит 300 мг казугамицина. 90 смо активного элюата заливают в колонку диаметром 0,8 см, заполненную активированным углем (продукт Га 1 о), После промывки 50 мл деионизированной воды казугамицин вымывают 0,5 н, НС 1 в виде его солянокислой соли 30,2 мл активного элюата содержат 180 мг казугамицина, Злюат упаривают во вращаюЗаказ 1227/19 Изд Ло 532 Тираж 473 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений п открытий при Совете Министров СССР Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Типография, пр, Сапунова, 2 щемся испарителе при пониженном давлении и температуре ниже 40 С. К 5 мл концентрата добавляют десятикратный объем эталона для осаждения казугамицина, Осажденный казугамицин высушивают, и получают 140 мг сырых кристаллов, содержащих 132 мг казугамицина. Эти сырые кристаллы растворяют в 8 мл воды и добавляют 12 мл этанола. После отстаивания при комнатной температуре получают 96 мг кристаллического казугамицина, Идентичность этих кристаллов с солянокислым казугамицином подтверждена инфракрасным спектром, хроматографией на бумаге, хроматографией в тонком слое, высоковольтным электрофорезом и элементарным анализом.П р и м е р 2. В колбы емкостью 500 мл вносят по 80 мл среды, состоящей из 5% соевой муки и 4,0 о/о соевого масла (рН не регулируют), и инокулируют ее штаммом. Инкубируют при 27 С во взбалтывающей машине, делающей 144 ходамин с амплитудой 8 см. На восьмой день рН достигает 7,5. Получают 3570 мкг/смз казугамицина. 920 мл культуральной жидкости центрифугируют для удаления мицелальной массы. К полученной прозрачной жидкости, содержащей 3570 мкг/мл антибиотика, добавляют 400 мл этилового эфира бдля удаления оставшегося масла. Нижний слой упаривают для удаления этилового эфира, и получают 750 мл жидкости, содержащеи 4250 мг/мл антибиотика.5 Эту жидкость пропускают через хроматографическую колонку диаметром 3,2 см с углем, После промывки водой элюируют 0,05 н. НС 1 и собирают активные фракции, которые нейтрализуют и концентрируют до 20 мл. К ним 10 добавляют этанол для осаждения неочищенного порошка. Последний растворяют в 20 мл воды, добавляют 35 мл этанола и оставлгоот стоять на ночь, после чего получают 2,65 г кристаллического вещества. Его идентифици руют с солянокислым казугамицином по точке плавления, оптическому вращению, инфракрасному спектру и другим свойствам,Предмет изобретения 20 Способ получения антибиотика казугамицина, включающий культивирование гриба-продуцента рода Яер 1 оптусея в аэробных условиях глубинным методом на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота 25 и минеральных солей, отличающийся тем, чтов качестве гриба-продуцента берут Ягер 1 опчусея Каяцдаяр 1 ппя, а культивирование ведут при температуре 25 - 35 С.