411072

Зависимое От авт. свидетельс М. Кл. С 07 с 47 72 ( 174117723 аявлецо 18,. присоединением заявкиГааударатвеииый камитеСовета Мииистрав СССРпа делам изабрете 11 ийи открытий иоритет Опублцкова 1 5.1.1974. Бюлл сньДК 547 455(088.8 ата опубликования описания 1 З.И.19 Авторзобретени И. И, Гаврил 10 кзиологии и биохимии растений АН Молдавской чистит явител СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИ МОНОСАХАРИДОВ Изобретение относится к улучшенному способу разделения смеси моносахаридов, который находит широкое применение в биохимии и биологии.Известен способ разделения смеси моносахаридов методом тонкослойной хроматографии, заключающийся в том, что на пластинку с абсорбецтом наносят смесь моносахаридов, которую разделяют, используя различные системы растворителей.В качестве абсорбента в известном способе применяют силикагель Г, кизельгур Г или окись алюминия (производства фирмы Мерк) и используют гипс как связующий материал, Причем силикагель должен быть тщательно очищен от примесей железа, Однако, Использование гипса как связующего материала уменьшает величины Йп что приводит к плохому разделению сахаров.Для импрегнирования слоя абсорбента в известном способе используют 0,02 М раствор ацетата натрия (по Шталю) или 0,1 н. раствор борной кислоты (по Пастуска). При использовании ацетата натрия количество анализируемоц смеси должно быть очень небольшим, 0,1 - 1,0 мкг, так как зоны перекрывают друг друга, а применение борной кислоты приводит к сильному потемнению фона, поэтому невозможно количественное определение отдельных сахаров. Таким образом известный способ пригоден только для ультрамцкрояцалцза смеси сахаров, причем используют специально приготовленные абсорбенты, подбирая систему растворителей для каждого сорбента в отдельности,Цель изобретения - ус 1 ранение указа 1 шых недостатков путем использования нового сорбснта, нового связующего материала, фосфятцого буфера для цмпрегнированця слоя сорбента и новых систем растворителей.Все это дает возможность разделять до 90 мкг каждого сахара в отдельности и наносцть до 720 мкг смеси сахаров,Предлагаетс;1 способ разделегц 1 я смеси мо- цосяхярОВ методом тонкослойной хромятографпи, заключающийся в том, чго смесь моносахаридов наносят на пластин с абсорбццон. ным слоем, состояшцм цз сцлцкагеля КСК, силикатного клея н буферного раствора фосфорнокислых солей высокой концентрации с последующим разгоном системой растворителей, подООРацноц В завпснх 10 стц От Вида с 11 х 11 РЯ. Обычно для буферного раствора используют 0,88 М раствор КЯН,РО ц 0,31 М раствора МЯ,1-1 РО, в соотношении 88; 13.Для разделения галактуроновой кислоты, галактозы, глюкозы, арабцнозы+манцозы, ксилозы, рибозы и рамнозы, как правило, используют две системы растворителей;45 60 65 А. и-Бутацол, ацетон, метанол, вода в соотношении 12: 12: 6: 3;Б. Изопропацол, этилацетат, вода в соотношении 8: 1: 2.Для разделения арабипозы и маццозы обычцо используют смесь ацетона и воды в соотцошсции 12; 1.П р и м е р. Очистка силикагеля, Берут один объем гранулированного силикагеля марки КСК, кипятят 30 миц с 1,5 объемами 1%-цого раствора МаОН, после чего декацтируют и силикагель промывают дистиллированной водой до цейтральцой реакции. Затем кипятят его в ,5 об.ьемах концентрированной соляной кислоты в течепие 30 миц. Кислоту сливают и очищеццый продукт промывают дистиллированной водой до отсутствия ионов хлора, после чего сушат в термостате при 140 (в течецие 6 час),Измельчецие силикагеля. Высушенный силикагель измельчают ца шаровой мельнице.Фракциоцировацие, Полученный силикагель помещают в сосуд емкостью 10 л, заливают дистиллированной водой и интенсивно перемешивают, Перемешивацие прекращают и засекают время по секундомеру, Через 14 миц после прекращения перемещения сливают 1/3 смеси во второй 50-литровый сосуд, Первый сосуд вновь заполняют дистиллировапцой водой, перемешивают и сливают 1/3 смеси во второй сосуд. Повторяют эту операцию до тех пор, пока при сливации будет наблюдаться взмученный в воде силикагель. После отстаивация воду декацтируют и силикагель сушат ца воздухе. Высушенный ца воздухе силикагель нагревают в сушильном шкафу 2 час при 120 С. Силикагель используют для приготовлеция пластинок.Примеси железа, если и содержатся в силикагеле, це влияют ца хроматографировацие сахаров. Для приготовления пластинок со слоем силикагеля используют стеклянные, предварительцо отшлифованные и тщательно обезжиреццые, фотопластинки (17,813,2 см), Состав суспецзии для покрытия пластинок из расчета ца одну пластицку включает 15 мл фосфатцого буфера, состоящего из 0,88 Л КаНРО 4 и 0,31 М ХазНРО 4 (88:13), силикатцый клей 0,4 мл, силикагель 3,0 г. Компоцецты смешивают, полученную сор бциоцпую массу наливают ца пластинку и сушат в строго горизонтальном положении ца воздухе це менее 8 час. Это обеспечивает получение слоя 0,2 мм. Пластинки активируют при 145 С в течение 2 час. Хроматографию сахаров проводят при 20 - 22 С,Нанесение растворов. Растворы цацосят микропипеткой или микрошприцем. Для хроматографировация сахаров используют 0,3%- цый раствор сахаров в 80%-цом водном этаноле. На пластинку цацосят пробы различных количеств смеси, по 0,01 мм раствора, содержащего 20 - 60 мкг сахаров, После нанесения растворов стартовую линию подсушивают с помощью лампы накаливания в течение 3 миц. 5 10 15 20 25 30 35 40Растворитель Соединение А, Б 0 22 30 53 40 80 80 94 + 3 40 50 60 60 68 73 90 + Галактуроиовая кислотаГалактозаГлюкозаАрабинозаМаннозаРибозаКсилозаРамнозаСмесь сахаров 50 55 Определение состава продуктов гидролиза целлюлозы. Целлюлозу выделяют из плодов яблони методом Кюршцера. Для определения элементарного звена макромолекул выделенцую клетчатку гидролизуют. Растворы цейтрализуют карбоцатом бария, деиоцизируют и упаривают до небольшого объема. На готовые пластинки диаметром 17,8)(13,2 см, покрытые Качествеццый анализ сахаров, Хроматографию проводят в герметической стекляццой камере размером 150150 К 200 мм. Расход растворителя составляет примерно 200 мл, Для разделения галактуроцовой кислоты, галактозы, глюкозы, маццозы+арабицозы, рибозы, ксилозы и рамцозы подобраны две системы растворителей:А. н-Бутанол, ацетон, метанол, вода в соотношении 12: 12: 6: 3;Б, Изопропацол, этилацетат, вода в соотношении 8:1:2.Систему растворителей А дважды пропускали восходящим током при подъеме ее ца 16 см. Систему растворителей Б пропускали два раза ца 9,2 см и один раз ца 16 см от линии старта.Для разделения арабицозы и маццозы подобраца система растворителей В - ацетон и вода в соотношении 12:1. Разделение проводят при пятикратном хроматографировации. Время разгоцки 50 миц. После каждой разгонки пластинки подсушивают горячим воздухом в течение 15 мин. Разделение сахаров ца слое силикагеля происходит за 6 час. Для качественного определения сахаров используют проявитель - и-ацизидицфосфат (5 мл 85% -цой 1-1 зРО 4+0,5 г п-ацизидиц а+25 мл НзО+50 мл 95%-ного этацола),Хроматотраммы проявляют при 130 С в течение 15 миц.Полученные разноцветные пятна характеризуют следующие компоненты; темцо-коричцевая - галактуроцовая кислота; красцо-коричневая - галактоза, глюкоза; светло-красная - маццоза; светло-коричцевая - арабицоза, ксилоза, рибоза; желто-коричцевая - рамцоза, Значения К сахаров ца слое силикагеля приведены в таблице.Значения Й 1 (Х 100) сахаров на слое силикагельсиликатный клей импрегнированном 0,88 МИаН,Р 04 и 0,31 М 1 л 1 а,НР 04411072 Предмет изобретения Составитель Г. )Хукова Техред Г. Васильева Редактор Е. Хорина Корректор Н. Аук Заказ 1066/9 Изд.1166 Тираж 606 Подписное Ц 1-1 ИИПИ Государственного комитета Совета,1 пнпстров СССР по делам изобретений и открытий Москва, )К, Раушская наб., д, 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 биликагелем, калиброванной микропипеткой наносят одновременно на стартовую линию растворы анализируемых образцов и свидетелей. Объемы нанесенных растворов равняются 0,04 ммз, что является оптимальным объемом.Отдельно гоовят два раствора свидетелей с различным процентным содержанием сахаров. Первая смесь свидетелей объемом О,ОМ ммз содержит 480 мкг (смесь состоит из восьми сахаров по 60 мкг каждого). Вторая смесь свидетелей объемом 0,03 мм содержит 7 МО мкг и состоит из тех же сахаров по 90 мкг каждо 1 о.Хроматографцю проводят в герметической с 1 еклянной камере, как описано выше.,Эл 1 оц 1 но проявленных пятен сахаров проводят в день их проявления. Сразу же после проявления соскобленные пятна количественно переносят в М мл смеси 1/в-ной НС 1 и 0,1% -ной аскорбиновой кислоты в метаноле в соотношении 3: 97. Силикагель удаляют центрифуг 1 врованием (МО мин при 8000 об/ /мин). Количество сахаров определяют на спектрофотометре СФ, используя кварцевую кювету (1 см) с подставкой, применяемой для уменьшения объема элюента. Определение оптической плотности проводят при 650 нм, В качестве контроля используют равный по площади участок силикагеля, свободный от сахаров. Стандартные кривые строят для каждого сахара отдельно после разделения их на пластинке в прш 1 ятых условиях по МО - 60 мкг соответствующего сахара.В кислотных гндролнзатах целлюлозы этим методом обнаруживают кроме преобладаюгцего количества глюкозы (70% tа сухой вес целлюлозы) следы галактуроновой кислоты, галактозы, арабинозы и ксилозы. 1. Способ разделения смеси моносахаридовметодом тонкослойной хроматографии путем10 нанесения ее па слой абсорбента с последующим разделением системой растворителей,отличающийся тем, что, с целью увеличения количества и улучшения разделения смеси мопосахдридов, абсорбционный слой гото 15 вят нз снлнкагеля КСК, силикатного клея ибуферного раствора фосфорнокислых солейвысокой концентрации, а систему растворителей подбирают в зависимости от вида сахара.20 М. Способ по и, 1, отлнча 1 ощийся тем,что в качестве буферного раствора используют 0,88 М рдствор КаНРО, н 0,31 Ч растворМд,11 РО 4 в соотношении 88: 13.3, Способ по п. 1, отличающийся тем,25 что для разделения гдлактуроновой кислоты,галактозы, глюкозы, арабннозы+мдннозы,кснлозы, рибозы н рамнозы используют двесистемы растворителей;А, е-Ьутанол, ацетон, метанол, вода в со 30 отношении 1 М; 1 М; 6; 3;Б. Изопропанол, этилацетдт, вода в соотношении 8: 1: М,4. Способ по и, 1, отл ич а ющп йся тем,что для разделения арабинозы и маннозы нс 35 пользуют смесь ацетона и воды в соотношении 1 М; 1.