400116

400 И 6 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик Зависимый атента М аявлено 14.1.1970 (Ме 1394196/28-1 М, Кл 2 Л 13/10 ритет Государственный комитет Совета Министров СССР па делам изобретений и аткрытийпубликовацо ОЗ.Х.1973, Бюллетень хЪ 39ата опубликования описания 5.11.1974 15,07 (088,8) Авторыизобретени цыОнума и Хидео Аманофирмаи Кайша Иностранра, Шуньичи (Япония) Иностраннаяусэй Кабусик (Япония) Муцуо Симаму аявител Годо ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗ Изобретение относится к микробиологической промышленности,Известен способ получения щелочной протеазы путем культивирования Вас 111 цз 11 сйеп 11 огтп 1 в на питательной среде, содержащейисточники углевода, азота и минеральные соли, при щелочном значении рН с последующим выделением фермента из культуральнойжидкости.Г 1 ри известном способе щелочная протеаза 10проявляет свою активность при значении рН6,0 в 1 0,7.При предлагаемом способе щелочная протеаза является типичной щелочной протеазойсубтилизированцого типа, которая проявляет 15оптимальную активность при значении рН10,0 - 10,5 и не теряет свою активность привоздействии хелатирующего вещества (этилендиаминтетрауксу спой кислоты ЕДТА), аподвергается воздействию диизопропилфторфосфата (ДЕР).Предлагаемый способ получения щелочнойпротеазы осуществляют путем использованияштамма Вас 111 цв 11 с 1 теп 11 оггп 1 з АТСС Ме 21471или его мутантов, например У 1 - 25 Мд 202, 82, 2582 - 44, 82 - 44 - 02.Предлагаемый штамм бактерий выращивают на обычных для бактерий питательныхсредах при 30 - 35 С в течение 40 - 72 час,включающих глюкозу и крахмал в качестве 30 источника углевода, пептон ц казецц в качестве источника азота и минеральные соли. Кроме того, в среду добавляют такие вещестВа, как дрожжевой экстракг илп экстракт из обезжиренного соевого шротд и отрубей,П р и м е р 1. Вас 111 цв 11 с 11 еп 11 оггп 1 з нцкубируют в 1 л жидкой культуральной среды (рН ,2), содержащей, ",Ь: глюкозы 1, пептона 1, дрожжевого экстракта 0,1, хлорида натрия 0,2, хлоридд кальция 0,2, фосфата калия 0,05, сульфата мапшя 0,01 и сульфата железа и сульфата марганца по 0,001.Вас 111 цз 11 с 11 еп 11 огп 11 в выращивают прц встряхивании в течение 72 час при 30 С. По. лученцый бульон содержит алкалпцовую протеазу, обладающую активностью 1,930 ед ца 1 мл. Бульон культуры дебактеризуют с помощью центрифуги или фильтра, после чего фильтрат смешивают с 0,8 с 4.цым насыщенным раствором сульфата аммония, и смесь подвергают высаливанию и диалцзу. Диализованный раствор пропускают через колонку, заполненную диолитовой смолой Л(или аниоцообмеццой смолой) для удаления окрашивающих веществ. Обссцвечснцьй раствор подвергают колончатой роматографш 1, используя карбоксиметнлцеллюлозу и ДЕЛЕСерадекс, а затем сырую протеазу отделяюг посредством гель-фильтрования, применяя Серадекс. Затем сырую протеазу подвер 400116гают осажденио с применением ацетона для получения очишенной протеазы, после чего высушивают и измеряют, взвешивая 47 мг высушенной протеазы, имеющей активность 4,110 ед/чг.П р и м е р 2. Вас 11 цэ 1 с 1 споггпэ инкубируют в 1 л жидкой культуральной среды (рН 7,2), содержащей экстракт, полученный экстрагированием обезжиренных соевых лепешек с 4%-ным алкалиновым раствором. Растворимый крахмал (1%) и Вас 11 цэ 1 с 1 еи 1 оггпв кульгивируют в Лаг-фермснтаторс в течение 40 час при 35 С при аэрации и персмешивании, Г 1 олученцый бульон культуры содержит алкалиновую протсазу, имеющую активность 4,400 сд. па 1 мл. Бульон обрабатывают так жс, как и в примере 1, дав 1,07 г очищенной высушенной протеазы с активностью 4,110 ед/хг.Характеристика штамма Вас 1 цэ 11 с 1 зсп огтпэ.Бактериологические свойства.Растительные палочки (микробы) размером 0,6 - 0,8 К 1,5 - 3,0 мк, нс в виде цепочек, без капсулей или теневых форм, Подвикныс. Грам-положительны. На глюкозном питательном агаре палочки (микробы) такие яс, что и на питательном агаре, и содержат немного жировых шариков (глобул). Спорангии - нс четко набухшие, напоминают палочки (микробы) с биполярным окрашиванисм.Споры размером 0,6 - 0,9(1,0 - 1,5 мк, овальной или цилиндрической формы, центральные или парацентральные, тонкостенн.с, многочисленные за 48 час при 37 С,Колонии па питательном агарс - грубая поверхность, волосатые отростки, рост культуры микробов на поверхности. В условиях косого агара - обильный рост, грубая поверхность полупрозрачная, рост культуры по поверхности, поверхность матовая, волосатые отростки.Питательный бульон - прозрачные с тяжелой, морщинистой плотной оболочкой.Культура микробов, полученная уколом в желатину, как питательную среду, - быстрое разжижение с переходом из бокалообразных форм в слоистые. Питательный бульон с )хаС 1 - хорошийрост в 5 - 8%-ном растворе 1 х 1 аС, отсутствие роста в 12%-ном растворе ХаС 1,В условиях питательной среды из глюкозы и косого агара - тяяелый рост, складчатость, морщинистость, выдавленные капельки и слизистый.В условиях питательной среды из прозинаи косого агара- рост такой жс, что и на питательном агаре.10Использование цитрата - положительно.Картофель - рост тяжелый, распространяются по поверхности, морщинистые, выдавленные, бородавчатые капельки, розовые,красныс и бурые на поГружсцно до,с артофсля.В условиях итательо среды из соевыхбобов и косого агара - рост более мягкий и0 более обильный, чем ца питательном агаре,цвет от буроватого до красноватого, выдавлсшыс капельки.В условиях нитрата глюкозы и косого агара - рост медленный, волосистые отростки,25 впоследствии рост от умеренного до обильного.Гидролиз крахмала - положительный.Продуцирование ацетилметилкарбинолаположительное (32 С) рН питательного бульз 0 она с глюкозой - рН 5,6 за неделю.Фермента ционный тест (опыт сбраживания) - кислота без газа из арабинозы, ксилозы, глюкозы, сахарозы или маннитола (за14 де) .35 Гидролиз казсина - положительный, узкая зона осветления,Гидролиз келатины - положительный, широкая зона гидролиза. Восстановление нитрата в нитрит - положитсльнос, Анаэробный40 рост в питательном бульоне из глюкозыположительный, рН 5,2 через 14 дней, получается очень малое количество газа.Температуры для роста - хороший рост 45 при температуре от 32 до 45 С.Морфология мутантов существенно пе от.личаотея от основного штамма.В данном способе могут быть использовапы следующие мутанты из Вас 111 цэ 1 с 1 е 1 огппэ АТСС 21471 (см. таблицу),400116 Протеазнаяактивность, ед,мл Мутанты Стойкость фага Способ вариации Облучение Уф-лучамиЗаражение фагами Ъ - 25То же Ч 1 - 25 6,750 6,800 6,860 6,80082 - 44 - 20105 Заражение фагами И - 25 То же Лп - 1, - 2, - 7 То же119 Естественная вариация170 То же Предмет изобретения Составитель М. Ларина Техред Т. Ускова 1(орректор О, Тюрина Редактор А. Бер Заказ 182/7 Изл.106 Тираж 467 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Минисгров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж.35, Раушская наб д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2122126167170170 - 04170 в170 в170 - 13 Способ получения щелочной протеазы путем культивирования Вас 111 цз 11 с 1 теп 11 опп 1 з на питательной среде, содержащей источники углевода, азота и минеральные соли, при ще 6,780 6,850 6,750 6,780 6,810 6,500 6,570 6,550 6,700 6,800 7,200 7,500 7,800 7,600 7,900 лочном значении рН с последующим выделением фермента из ку льтуральной жидкости, отличающийся тем, что используют штамм Вас 11108 11 с 1 теп 11 оггпЬ АТСС21471 или его 5 мутанты, например, Ч 1 - 25,202, 82, 82 -44, 82 - 44 - 02.