Способ получения инозина

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических ВеслубликЗависимое от авт, свидетельства-1645945/28-13 явлено 12.17.197 М. Кл. С 126 13,0 инием заяв с присое осударственный комитетСовета Министров СССРпо делам изобретеиийи открытий Приоритет -Опубликовано 23.7,1973. Бюллетень23 УДК 663.11(08 писан:;я 9:1,1973 Дата опубликова Авторыизобретен С, И. Алихаиян, Л. И Т, А. Шишкина,А, Ф. Шолин, Н, В Всесоюзный научно-ис пром, Ерохина, Л. А. К Н, А. Кострпкина, , Матвейчук, Т. В следовательский и ышлениых микроо Р, М, Балицкаюгов-Бабаев,Ю. А. Журинетики и селекц азаринова, Л. М. ЕвсАшот ко и Заявите нститут ге рганизмов ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНОЗИНА мпнеральпым ионооб- нтриро- перед Изобретение относится к микробиологической лромытплвнности.Известен способ,получвния инозина путемвыдр а щиваяния продуцирующих его мслкроорганиэмов рода Вас 11 цэ на питательной среде,содержащей источники углевода, органического и:неорганического азота, аденина, необходимые аминокислоты, минеральные солии стимуляторы роста при пере,мешивгйииаэрации среды, отделения биомассы извлечения инозина из культуральной среды гктивированным углем, отделения инозина от угляпромывкой, осветления раствора на ионообмвнной смоле с последующим осаждениемикоэина из раствора этиловым спиртом.Предлагаемый способ позволяет увеличитьвыход,инозина.Для этого в качеспве продуцирующихмикроорганизмов используют штамм Вас 111 цззцЫ 111 э Ген, не продуцирующий аденин,тирозин, гистидин,В качестве источника углевода можно использовать мелассу, гидрол, а в качестве источнлка аденина, аминокислот и органического азота - куку 1 рузный экстракт, соевую мукуили белково-витаминный концентрат. Пвред осветленивм раствора нменной смоле желательно его кон ать упариванивм под вакуумом,осаждением проводить вторичное упариванпе,также,под ваоуумом.Штамм Валцз зцЬ 1111 з Ген - 265 имеетследующие свойства.5 Граммположительная, спорообразующаяпалоч,ка,На мясо-пептонном агаре (сутки роста при37 С) образует желтовато-серые круглые колонии диаметром 2 - 2,5 лл, шероховатые,0 с лопастным краем кожкстой консистенции.При посеве штрихом на мясо-,пептонномагаре (сутки роста тори 37 С) наолюдаетсяумеренный рост, штрих широкий, опаловыйс лопастным краем и матовой шероховатой5 поверхностью, кожистой консистенции.На мясо-пептоннам бульоне образует морщинистую сухую пленку.На ломтиках картофеля пигмент не образует, .имеет матовую су ую складчатую по 20 верхность,Желатину разжижает; крахмал - гидролизует; молоко - ,пептонизирует,Во всех случаях роста на полноценныхоредах присутствует запах, характерный длякультур вида Вас 111 цз зцЫ 11 э,На синтетических средах сазобом рост отсутствует.Штамм нуждается в добавке аденина, тирозина, гисъидина, Оптимальная температураз 0 для роста 37 С. При ферментации на спе2,0 1,0 1,0 0,25 Инокулят инкубируют в аэрируемых условиях (на качалке) при 28 С в течение 24 час. Посевной материал передают в ферментационную среду в количестве 2 - 5 об, %. циально составленных средах, содержащихнепищевое сырье, штамм Геннакапливает до 10,0 г/л инозина.Хранение штамма производят в виде лиофильно высушенных культур в стеклянныхампулах,В предлагаемых средах в качестве основных источников углеводов, аденица и аминокислот используют отходы пищевой промышленпоспи и пищевое сырье (свекловичная меласса, ги 1 дрол, кукурузный эистракт, соеваямука и белково-витаминный конценгратБВК) .При использовании в качесгве источникауглеводов для микробиологического синтеза,инозина мелассы в ферментационную среду,а следовательно, и культуральную жидкостьвносят зцачительиое количество цеорганических солей, окрашенных соединений, оргацических соединений кислого и основного характеров,Эти соединения стильно затрудняют выделевие инозина,На стадии выделения для отделения биомассы культуральную жидкость центрифугируют и к супернатанту добавляют для адсорбции иноэина активизированный уголь марии СТ (100 - 250 меш) из расчета 100 мг угляна 10 мг цуклеозида.После перемешивания уголь огфильтровывают. Инозин элюирует шестикратной экстракцией водно-спиртовыи,расгвором аммиака и фильтраты концентрируют в вакууме до1/10,первоначального объема,Поскольку полученный сконцентрированный раствор сильно окрашен, то его осветляют, пропуская через колонату с крупнопористой смолой на осцове метафенилендиамина и формальдегида, Смола обладает болеесильньгми адсорбционцыми свойствами по отношению к пигментам мелассы, чем к нуклеозидам.Выходящую бесцветную жидкость, содержавшую инозин, упаривают под вакуумом идля осаждения инозина добавляют четыреобъема эгилового спирта.Инозин кристаллизуют на холоде в течение нескольких часов, отфильтровывают и высушивают,на воздухе.П р и м е р 1. Размножение культуры осущест 1 вляют в несколько этапов,Ее поддерживают на агаре Хоттингера иинкубируют при 37 С в течение 24 час. Культуру со скошенного агара Хоттингера переносят на жидкую, посевную среду следующегосостава, %:ГлюкозаПептонДрожжевой экстракт1 ч аС 115 20 Предварительно уголь кипятят с 3 М соляной кислотой и отмывают до цейтральной реакциями. Раствор с а(ктивированным углем перемешивают 15 - 20 мин, после чего отфильтровывают под вакуумом через бумажный фильтр. После промывания угольных осадочков водой пнозин извлекают спиртовым раствором аммиака (СН 5 ОН: КН 40 Н: вода - 25: 55: 1: 24). Используют ферментационные среды следующего состава, %:Ферментационная среда 1Мел асса 20,05 Кукурузный эктракт 3,0(1 Н 4),804 2,0СаСО 2,0КНРО 0,2КНР 04 0,21 О МдЯ 04 7 Н 20 0,4Вода водопроводнаяФерментациоццая среда 2Меласса 20,0Кукурузный экстракт 3,0Мочевина 0,6СаС 1 2 НО 0,01КН 2 Р 04 0,2КНР 04 0,2Мд 504 7 НО 0,2Вода водопроводнаяПроцесс ферментациси проводят методомглубинного,ку,тьгивирования в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащих 15 млсреды, на качалке, деламщей 220 - 250 об/мин,или металлических ферментерах емкостью20 л с турбинной мешалкой (скорость700 оо/мин), барбатером и системой автоматического пецогашеция.Перед цача.том ферментации значение рНсреды должно быть близким к нейтральному(перед стерилизацией,рН среды доводят раствором 11 аОН до 7,0 - 7,2),Оптимальцая аэрация для указанных средсоответствует скорости растворения кислорода (35,0 мг О, л в мин),Уменьшение скорости растворения кислорода в среде подавляет биосинтез инозина.Опгимальной телюпературой процесса биосинтеза является 28 - 30 С. При понижении4 О или повышении температуры на 4 - 6 С биосинтез инозина в значительной степени тормозигся.При оптимальных условиях ферментацпимаксимальное накопленне инозина наблюда 45 ется на шестые сутки. В конце ферментациив культуральной жидкости наканливаетсядо 7,0 г/л инозина.Для выделеция,инозина культуральцуюжидкость (600 мл) центрифугируют 30 мин.Показатель преломления центрифугата равен1,3512; вязкость раствора 3,8 сп; рН растворапосле,прибавлеция 1,5 мл концентрированнойсоляной кислоты, равен 7,0.К центрифугату добавляют 30 г активированного угля СТ (100 - 250 меш) .382676 Состав посевной среды, %:Гидрол 4,0 Кукурузны 11 экстра 1 кт 2,0 Б, В, К. 1,0Н 4 ХО. 0,5 СаСОз 1,0 Состав ферментацпонной среды, /рГидрол 20,0 Кукурузный экстракт 2,0 Б. В, К. 1 0 Х Н 4 ХОз 2,0 СаСОз 2,0 Вода водопроводная Предмет изобретения Составитель В. Дунье Техред Г, Дворина Редактор А. Либкина Корректор А. Дзесова Заказ 434/1278 Изд. Мо 591 Тираж 467 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета .1 инистров СССР по делам пзооретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Тип. Харьк. фил. пред. Патент После шестикратной экстракции объемфильтрата,равен 600 ил.Полученный концентрат пропускают черезколонку со смолой ИА - 1 на основе формальдегида и парафенилендиамина и фенола (высота 5 с,ц, объем 10 ил) со скоростью 1,5,11,гв 1 1 гин. Затем колонку промывают двумяобъемами воды с той же скоростью и фракции, содержащие инозин, объединяют и упарзивают в,вакууме при 40 С до 10 льг. 1 ОДля осаждения инозина к раствору дооавляют 40 игл этилового сп 1 ирта,и,раствор выдерживают при 40 С 10 час, Выпавшие кристаллы отфильтровывают и перекристаллизовывают из водно-спиртового раствора. Кристаллы высушивают в вакуум-экстракторе надСаС 1,Выход инози 1 на на стадии кристаллизац;1ЗЗР/р,Маточные растворы добавляют к следующей партии концентрата и вместе с нимос 1 ветляют на колонке со,смолой ИЛ.П р и м е р 2. Штамм-продуцент, услов: яферментации и выделения инозина те же, чтои в н 1 р 1 и 1 мере 1. Отгличие состоит в составе посевной среды.Посевная среда содержит, Р/,:Меласса 4,0Кукурузный экстракт 2,0(КН 4) з 304 0,5 30СаСО, 1,0Вода водопроводнаяСодержание инозина в конце ферментацпп7,2 г/л,П р и м е,р 3, Штаммипродуцент, условияферментации и выделения инозина такие же,как в примере 1. Отличие в составе ферментационной среды.Состав ферментационной среды, Р/р:Мел асса 20,0 40Соевая мука 5,0КН 4 КОз 2,0СаСОз 2,0Вода водопроводнаяСодержание инозина в конце ферментации 456,7 г/л.П,р и м е р 4. Штами-продуцент, условияферментации и выделения инозина такие же,как в примере 1, Отличие в составе посевнойи ферментационной сред. 50 Содержание инозина в конце ферментацпп10 г/л. 1, Способ получения иноз 1 пга путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов рода Васгпз на питательной среде, содержащей источнп 1 ки углевода, органического и неорганичеокого азота, аденпна, необходимые амгинокислоты, минеральные соли и стимуляторы роста при перемешивании и аэрации среды, отделения биомассы, извлечения инозина пз культуральной среды активированным углем, отделения инозина от угля промывкой, осветления раствора на ионообменной смоле с последующим осаждением инозина из раствора этиловым спиртом, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода инозина в качестве продуцпруюших микроорганизмов используют штамм Васгпв зпЬ 11 з Ген, не продуцирующий аде 11, тирозин, гистидин.2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что в качестве источника углевода используют мелассу, гидрол, а в качеспве источпгика аленина, аминокислот и органического азота ку 1 курузный экстракт, соевую муку илз 1 белково-витаминный концентрат.3, Способ по п,п. 1 и 2, отличающийся тем, что перед осветлением раствора на понообменной смоле его концентрируют упариванием под вакуумом, а перед осаждением проводят Вторичное мпарпванпе, также под Вд 1 й- мом.