Способ получения протеолитических концентратов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1837 НОЕ ПАТЕНТНОЕССРССР) йМЮ Н г поджелудо тем пердтур Изобретение относится к переработке ерментного сырья; в частности к производтву ферментных концентратов, обладаюцих протеолитической активностью, оторые могут быть использованы для выдеения высокоочищенных ферментных преаратов, таких как дезоксирибонуклеазы ДНК-аза), рибонуклеаза (РНК-аза), трипин, химотрипсин, трипсиноген, химотрипиноген и катепсин-С,Цель изобретения - предварительное ведение в экстракт 0,02-0,2 моль/л моЧеины и использование в кэчестве животного ы рья замороженных естествен н ым холоом до температуры минус 3 - 5 С поджелуочной железы и селезенки северного леня, использование которых позволит боее полно удовлетворить потребность биоимичес кой и медицинской 1 ромышленности в протеолитических ферентах. В настоящее время из-за удаленноти регионов обитания северного оленя от ест переработки эндокринно - ферментно.о сырья поджелудочная железа иселезенка не используются, следовательно получение протоконцентратов на местах убоя живоных (бойнях) позволит не только рациоК 35/39, А 23 1 1/31 нально использовать оленеводческую продукцию, но и высвободить для производства инсулина дополнительное количество поджелудочной железы, перерабатываемое в настоящее время для получения протеолитических ферментов.Сущность способа заключается в том, что для удобства измельчения поджелудочную железу или селезенку северного оленя замораживают до температуры минус 3- 5 ОС, для стабилизации белковых структур при гомогенизации в сырье вводят 0,02-0,2 моль/л мочевины, экстагирование ферментов ведут в течение 1-5 час при температуре 5 - 38 С и рН 2,3-4,5. По окончании экстракции отделяют негидролизованные остатки ткани, а экстракт лиофильно высушивают. Для очистки экстракта в некоторых случаях предусматривается высаливание балластных белков с обязательным отстаиванием экстракта, удалением осадков и лиофилизацией экстракта.Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами.Пример 1.10 к чной железы замораживают до ы ми. нус 3 С, измельчают ее до са затем фарш гомогенизируют в 4 объемах (от массы измельченного сырья) охлажден- ного до минус 1 ф С водного раствора, содержаще-го 0,2 моль/л мочевины, Гомогенизацию ведут при температуре не выше 5"С в течение 3 5 мин, после чего к гомогенату прибавляют 5 н, раствор серной кислоты до рН 2,3 и при постоянном перемешивании и вышеуказанной температуре проводят экстрагирование ферментов, Через 5 час в экстракт прибавляют сульфат аммония до 0,23 насыщения и после часового перемешивания проводят формирование осадка при температуре 3 С в течение 6 часОбразовавшийся осадокудаляют центрифугированием при температуре не выше 5 С, а фугат лиофильно высу-, шивают. Полученный концентрат представляет собой порошок белого цвета в котором содержится 5,4 влаги, 2,3 жира и 40,1 белка. Содержание ДНК-азы составляет 0,08 Ед/мг; трипсин+химотрипсин - 0,8 Ед/мг, а РНК-азы - 0,05 Ед/мг концен; трата.П р и м е р 2, 1,0 кг поджелудочной железы замораживают до температуры минус 5 С, измельчают ее до состояния фарша, а затем фарш гомогенизируют в 4 объемах охлажденного до 0 С водного раствора, содержащего 0,2 моль/л мочевины, Гомогенизацию ведут при температуре не выше 5 С в течение 10 мин, после чего к гомогенату . прибавляют 5 н раствор серной кислоты до рН 3,5 и при постоянном перемешивании и вышеуказанной температуре проводят экстрагирование ферментов. Через 5 час после перемешивания экстракта в него прибавля- . ют мелкими порциями сульфат аммония до 0,23 насыщения. Формирование осадка проводят при температуре 6 С в течение 12 час. Осадок из экстракта удаляют центрифугированием при температуре не выше 5 С, а фугат лиофильно высушивают. Полученный концентрат представляет собой порошок белого цвета, в котором содержится 10,16 влаги, 4,9 жира и 65,9 белка. Содержание ДНК-азы составляет 1,6 Едмг, трипсин+химотрипсин - .2,1 Ед/мг, а РНК- аэы - 1,1 Ед/мг концентрата.П р и м е р 3. 1,0 кг селезенки замораживают до температуры минус,3 С, измельчают ее до состояния фарша, а затем фарш гомогенизируют в одном объеме охлажденного до ОС водного раствора содержащего 0,04 моль/л мочевины. Гомогенизацию ведут при температуре не выше 5 С в течение 3 мин, после чего в гомогенат прибавляют 5н.раствор серной кислоты до рН 2,3 и при энергичном перемешивании ведут экстрагирование ДНК-азы в течение 1 часа, По истечении указанного времени экстракт отстаивают при температуре 5 С в течение 18 час, а затем из экстракта удаляют нерастворившиеся ткани путем центрифугирования. фугат лиофильно высушивают, Полученный концентрат представляет собой порошок бледно-розового цвета, в, котором содержится 5,83 влаги и 60,0 белка, Специфическая ДНК-азная активность 1 мг концентрата составляет 0,07 Ед.П р и м е р 4. 1,0 кг селезенки замораживают до температурыминус 5"С, измельчают ее до состояния фарша, а затем фарш гомогенизируют в 1 объеме охлажденногодо 1 С.водного раствора, содержащего 0,04моль/л мочевины, Гомогенизацию ведут при температуре не выше 5 С в течение 10 мин, поеле чего в гомогенат прибавляют 5 н, раствор серной кислоты до рН 3,5 и при энергичном перемешивании в течение 1,5 час ведутэкстрагирование ДНК-азы. По истечение укаэанного времени экстракт отстаивают при температуре 5 С в течение 24 час, после, чего удаляют остатки нерастворившейся ткани центрифугированием, а фугат лиофильно высушивают, Полученный концентрат представляет собой порошок бледно-розового цвета, в котором содержится 10,0 влаги и 80,0 белка. Специфическая ДНК-азная активность 1 мг концентрата составляет 0,5 Ед.П р и м е р 5. 1,0 кг селезенки замораживают до температуры минус 3 С, измельчают ее до состояния фарша, а затем фарш гомогенизируют в одном объеме охлажденного до 0 С водного раствора, содержащего 0,02 моль/л мочевины. Гомогенизацию ведут при температуре не выше 5 С в течение 3 мин, после чего в гомогенат прибавляют 5 н. раствор серной кислоты. до рН 3,0 и в течение 30 мин проводят интенсивное первмешивание смеси при комнатной температуре. Остатки соединительной ткани удаляют из экстракта путем центрифугирования, а в фугат прибавляют гидроокись натрия до рН 6,0 и сульфат аммония до 0,4 насыщения. Смесь отстаивают в течение 1 час и удаляют из нее образовавшийся осадок путем центрифугирования, Осадок отбрасывают, а фугат лиофильно высушивают. Полученный концентрат представляет собой порошок бледно-розового цвета, в котором содержится 4,9 влаги, 59,5 белка и 9,7 минеральных веществ, Специфическая РНК-азная активность 1 мг концентрата составляет 0,7 Ед.П р и м е р 6, 1,0 кг селезенки замораживают до температуры минус 5 С, измельчают ее до состояния фарша, а затем фарш гомогенизируют в одном объеме охлажденного до 1 С водного раствора, содержащего,2 моль/л мочевины. Гомогенизацию ведут ри температуре не выше 5 С в течение 10 ин, после чего в гомогенат прибавляют 5 н, аствор серной кислоты до рН 5 и в течение 0 мин проводят интенсивное перемешиваие смеси при комнатной температуре. Осатки соединительной ткани удаляют иэ кстракта центрифугированием, а в фугат рибавляют гидроокись натрия до рН 8,0 и ульфат аммония до 0,4 насыщения. Смесь тстаивают в течение 2,5 час, удаляютиз нее бразовавшийся осадок центрифугироваием, а фугат лиофильно высушивают, Полченный концентрат представляет собой орошок белого с розоватым оттенком цвеа, в котором содержится 9,9 влаги, 70,1 елка и 5,3 минеральных веществ. Специическая РНК-азная активность 1 мг конентрата составляет 2,0 Ед.П р и м е р 7. 1,0 кг селезенки замораивают до температуры минус 3 С, измельают ее до состояния фарша, а затем фарш омогенизируют в течение 3 мин в 2 объемах от массы селезенки) водного раствора, соержащего 0,02 моль/л мочевины, По истеении указанного времени в гомогенат рибавляют 5 н. раствор гидроокиси натрия о рН 7,0 и продолжают гомогенизацию в ечение 10 мин. В полученную суспензию обавляют 3,5 н,раствор серной кислоты до Н 3,5 и при температуре 38 С и интенсивом перемешивании ведут экстрагирование атепсина-С в течение 1 час. Затем в эксракт добавляют 10 мл толуола, смесь знерично перемешивают и оставляют при ышеуказанной температуре для отстаиваия на 20 час, при этом через каждые 3 час роводят корректирование рН, Из отстоявегося экстракта путем центрифугирования даляют нерастворившуюся часть ткани, в угат лиофильно высушивают;,Полученный онцентрат представляет собой порошок легка желтоватого цвета в котором содерится 4,9 влаги и 35,0 белка, Специфиеская катепсиновая активность составляет ,18 Ед/мг белкаП р и м е р 8, 1,0 кг селезенки замораивают до температуры минус 5 С, измельают ее до состояния фарша, а фарш омогенизируют в течение 10 мин в двух бьемах (от массы селезенки) водного расвора, содержащего 0,02 моль/л мочевины, о истечении указанного времени в гомогеат прибавляют 5, н.раствор гидроокиси нария до рН 7 0 и продолжают омогенизацию в течение 25 мин. В полченную суспензию добавляют 3,5 н. расвор соляной кислоты до рН 3,5 и при 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 температуре 38 С и интенсивном перемешивании ведут экстрагирование катепсина- С в течение 1,5 час, после чего в экстракт добавляют 10 мл толуола, смесь энергично перемешивают и оставляют при вышеуказанной температуре для отстоя на 26 час, при этом через каждые 3 час проводят корректировку рН. Из отстоявшегося экстракта удаляют нерастворившуюся часть тканей путем центрифугирования при температуре не выше 3 С. С фугата снимают образовавшуюся в результате охлаждения жировую пленку и подвергают его лиофильному высушиванию. Полученный концентрат представляет собой порошок слегка желтоватого цвета, в котором содержится 10,0 влаги и 45,5 белка. Специфическая катепсиновая активность составляет 0,5 Ед/мг белка.Формула изобретения 1. Способ получения протеолитических концентратов, предусматривающий измельчение животного сырья, экстракцию ферментов кислым. раствором при рН 2,3- 4,5, отстаивание экстракта, удаление йз него осадка и лиофилизацию экстракта, о т л ич а ю щ и й с.я тем, что в качестве животного сырья используют поджелудочные железы или селезенку северного оленя, при этом перед экстракцией в сырье вводят 0,02-0,2 моль/л мочевины.2. Способ по п,1, отл ич а ю щи йс я тем, что при. использовании в качестве сырья поджелудочной железы северного оленя перед отстаиванием в экстракт вводят сульфат аммония до 0,23 насыщения.3, Способ по п.1, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что при использовании в качестве сырья селезенки северного оленя с целью получения протеолитического концентрата, обладающего дополнительно рибонуклеазной активностью, экстракцию ведут при комнатной температуре, из экстракта удаляют нерастворившиеся ткани и затем вводят гидроокись натрия до значений рН 6,0-8,0 и сульфат аммония до 0,4 насыщения, образовавшийся в процессе отстраивания осадок удаляют,4., Способ по п,1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что при использовании в качестве сырья селезенки северного оленя с целью получения протеолитического концентрата, обладающего дополнительно катепсиновой активностью, после введения в сырье моче- вины в смесь вводят гидроокись натрия до рН 7,0, экстракцию и отстаивание экстракта ведут при 38 С, а перед отстаиванием в экстракт вводят толуол.