Способ определения антигепариновой активности препарата протаминов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 875 18 19) ( 1) 55 6 01 й 33/ ЗОБ РЕТ ИСАН И скии институ(54) СПОСО РИНОВОЙ Г 1 РОТАМИН ОПРЕДЕЛЕАКТИВ НОСВ А = 1/а (А+ В + где А = аС; В-ОСь,Сэ - концентр мг/мл;(71) 2-й Московский медиим, Н.И.Пирогова Изобретение относится к медицине, в частности к биохимическим методам определения биологической активности протамИнов, которые используются для нейтрализации гепарина после проведения оПераций на сердце.Цель изобретения - ускорение способа определения антигепариновой активности протаминов и определение вклада каждого компонента протамина в общую активность Поставленная цель достигается тем, что водный раствор протаминов центрифугиру-. ют, отбирают аликвоту и вводят в хроматограф при скорости подвижной фазы 0,5-1,0 мл/мин, промывают колонку элюентом, соде)жащим трифторуксусную кислоту в концентрации 0,1-0,5 при 25-45 С и опРеделяют антигепариновую активность прдтаминов по формуле:(57) Использование; в области медицинской биохимии. Сущность изобретения: водный раствор протаминов центрифугируют, отбирают аликвоту и вводят в хроматограф при скорости подвижной фазы от 0,5+1,0 мл/мин, промывают колонку элюентом, содержащим трифторуксусную кислоту в концентрации 0,1+0,5;ь, при 25-45 С и по формуле определяют антигепариновую активность, Способ позволяет определить вклад каждого компонента протамина в общую активность препа. рата. а также ускорить процесс определения активности препарата,нцентрация компонента мг/мл;а - концентрация исследуемого препарата, мг,Из литературных данных известно, что на антигепариновую активность препаратов протаминов влияет содержание основного компонента в промышленных образцах. При изучении влияния содержания протамина в препарате на их антигепариновую активность мы учитывали тот факт, что протамины, в частности, осетровых рыб, состоят из 2-х компонентов, имеющих различную антигепариновую активность. Нами была исследована зависимость антигепариновой активности препаратов протаминов от содержания индивидуальных компонентов А и 8 с использованием методов математического моделирования и планирования эксперимента.Для разделения протаминов была использована обращеннофазовая ВЭЖХ. 8 качестве элюента использовали воднозтанольный раствор, содержащий трифторуксусную кислоту, позволяющую уменьшитьионное взаимодействие протаминов с сорбентом,Для ускорения процесс хроматографирование проводили при оптимальном интервале температур 25 - 45 ОС, прикомнатной температуре (18 - 20 С) скоростьхроматографирования понижалась, вышеверхнего предела температуры происходила деструкция белка и появлялись дополнительные пики.В указанном интервале изменения скорости подвижной фазы происходит достаточно быстрое установление равновесия впроцессе массообмена между сорбентом ипоглощаемым веществом, что также вноситзначительный вклад в ускорение процессаопределения концентрации компонентов Аи В, Было показано, что вклад в общую активность препаратов протаминов А и В различен, Для нахождения зависимостиантигепариновой активности препаратовпротаминов от содержания их индивидуальных компонентов А и В был использованполинам 11 степени, Были приготовленымодельные смеси из компонентов А и В,Эксперименты реализовали в соответствии с планом второго порядка (см,таблицу, содержащим 9 экспериментальныхточек в области варьирования двух переменных, Границы варьирования концентраций компонентов А и В были выбраны наоснове литературных данных, а также в соответствии с рекомендациями по определению антигепариновой активностипротаминов. Была определена интигепариновая активность модельных смесей,В результате обработки экспериментальных данных, полученных при реализации плана второго порядка было найденоуравнение регрессии:А = а Са+ Ь Сь+ б Са + е Сь + Р,т 2где а,Ь,с,б,е,Р - коэффициенты в уравнениирегресии,Са и Сь - концентрации компонентов Аи В.Коэффициенты уравнения регрессииопределяли по методу наименьших квадратов, их значимость оценивали по критериюСтьюдента. Остальные коэффициенты вуравнении были статически незначимы и нами не учитывались, Была также построенамодель процесса на основании полученногбуравнения, которая адекватно описывалаэкспериментальные данные. Адекватностьмодели проверяли по критерию Фищера,Расчетная формула для определения антигепариновой активности протаминов имеетследующий вид:А = 1/О (236 Са + 77 СЬ + 26,4 СаСЬ127,5 С + 24 Сь + 4,9), (1) Таким образом, сочетание двух методов- обращеннофазовая ВЭЖК и математическое моделирование позволяет достаточно бь 1 стро оценить концентрацию индивидуаль ных компонентов и, на основе полученных ф результатов, рассчитать антигепариновую активность препаратов протаминов.Изобретение описывается следующимипримерами определения антигепариновой "0 активности протаминов.П р и м е р 1. Коммерческие препаратыпротаминов, выделенные из гонад осетровых рыб, в количестве 10 мг растворяли в 1 мл воды, центрифугировали в течение 10 15 минут при 3000 об/мин, отбирали аликвоту100 мкл и вводили в хроматограф. Использовали прибор модели Оц Ропт 8800 (США), применяя колонку ЕогЬах - ОООО. (0,46 х 25 см), Детектирование осуществляли при 20 длине волны 220 нм, Термостатировали колонку с помощью термостата с точностью +0,2 С, температуру колонки установили на 25 С, скорость подвижной фазы установили 0,5 мл/мин, градиент концентрации этанола 0,65 в минуту, концентрация трифторуксусной кислоты - 0,1 , Значение антиге. париновй . активности протаминоввычисляли по формуле (1). По хроматограмме были найдены значения концентраци 30 компонентов А = 0,30 мг/мл: В = 0,58 мг/мл. А = 1/О (А + В + С - О + Е + Р)А "аС 70,8мг35В - ЬСь = 44,7Ед .млС=сСь=45мг2О =1 Смг2Е=есь 81 Ед млмг45 Р= н=4,9Ед;О - концентрация исследуемого препарата, 1 мг,Экспериментально найденные значения; А = 121,7 Ед; время определения - 3550 минут, ошибка определения - 5 О/,П р и м е р 2. Пробоподготовка аналогична примеру 1, параметры хроматографирования: скорость подвижной фазы -мл/мин, температура колонки - 45 С, кон 55 центрация трифторуксусной кислоты -. 0,5, Экспериментально найденные значения;, концентрация компонента А - 0-32мг/мл; компонента В - 0,5 мг/мл, времяанализа 30 минут, Расчет значения антигепариновой активности;1803875 А = 1/О (А+ В + С - О + Е + Е) ЪМодельные смеси протаминов и их антигепариновая активность где А = эСа =, 75,5:В = ЬСь =40,0;С = сСь =.405;О = дС = 13,05;Е =еСь =5,6;Е=г=49; Омг,Значение А = 117 ЕД/мг, ошибка определения 6%.П р и м е р 3. Препарат протамина изгонад осетровых рыб, в количестве 10 мграстворяли в 1 мл дист, воды, центрифугировали, отбирали аликвоту 1.00 мкл и вводили в хроматограф. Параметрыхроматографирования: скорость подвижной фазы - 0,7 мл/мин, температура колонки - 35 С, градиент концентрации этанола0,65 ов мин, концентрация трифторуксусной кислоты - 0,25 о , Экспериментальнонайденные значения: концентрация компонента А = 0,28 мг/мл; концентрация компонента В = 0,60 мг/мл; время анализа 15минут, Значение активности препарата А =1/О(А+ В+ С - О+ Е+ ),где: А = аСа 66,08;В- ЬСь =46,2;С=сСь=4,4;О = дСэ = 10,0;Е-еСь =89;,Г =. г = 4,9,.Значение А = 120,5 ЕД/мг,ошибка определения 4,1%.Наиболее оптимальные условия для опредЕления антйгепарийовой активностипротдминов являются: скорость подвижнойфазы - 0,7 мл/мин, температура колонки -35 С, концентрация ТФУ - 0,25 6, что соответствует времени анализа 15 мин, ошибкиопределения 4, значению А = 120,5,Таким образом, при осуществлениипредлагаемого способа определения активности протаминов, не только сокрэщается время анализа, но и достоверно Определя ются концентрации индивидуальных компонентов протаминов, позволяющие оценить вклад в общую активность препарата отдельных компонентов, что особенно важно для клинической практики.10 Ф о р мула и зоб рете н ия Способ определения антигепариновойактивности препарата протаминов, включающий его растворение, центрифугирование 15 раствора, взятие аликвоты с последующейрегистрацией;отличающийся тем,что, с целью ускорения способа и определения вклада каждого протамина в общую активность препарата, аликвоту препарат вводят 20 в хроматограф при скорости подвижной фазы 0,5-1,0 мл/мин, промывают колонку злю- ЕНтОМ, СОДЕРжаЩИМ тРИфтОРУкСУСНУЮ кислоту в концентрации 0,1 - 0,5, при 25 - 45 С, определяют концентрацию препарата 25 и составляющих его протаминов, в общуюактивность препарата и индивидуальную активность протаминов рассчитывают по формуле 30 А = 1/О (А+ В+ С - О+ Е+ Г),где А = аСа, Вь Сь; С" с Сь; О = б С; Е = еСь;2,Г=4,9;а, Ь, с, б, е - коэффициенты;Са - концентрация компонента А,35 мг/мл;Сь - концентрация компонента В,мг/мл;О - концентрация исследуемого препарат, мг.40