Способ получения иммунной хламидийной сыворотки

ОЮЭ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕСКИЕСПУБЛИК 15)5 А 61 К 39/3 Я О К гибель и неспецифи сического действия активность сыворот изводственных усло ские аборты из-за то хламидий; невысок при получении в пр иях,ется упрощени й хламидийно вности и с тем,га м однощенные ые тель- аборта линсм в рейнда в аран оч ентар эног форм омф ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(56) Временная инструкция по изготовлению и контролю набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоэного аборта овец и коз и набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта овец и коз, ГУВ Госагропрома СССР, 1987,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННОЙ ХЛАМИДИЙНОЙ СЫВОРОТКИ(57) Использование: ветеринарная микробиология, биотехнология, иммунная сыворотИзобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к способу получения иммунных сывороток, и может быть использовано при производстве диагностических препаратов.Известен способ получения иммунной хламидийной сыворотки путем заражения суягных овцематок возбудителем хламидиозного аборта овец и забора крови через 1 мес после аборта.Недостатками прототипа являются: зависимость от физиологического состояния овец; отсутствие точного метода определения срока суягности овец; использование живого возбудителя хламидиозного аборта овец - в некоторых случаях наблюдается,1779383 А ка, диагностические препараты, хламидиоз. Сущность изобретения; возбудитель хламидиоэного аборта овец, выращенный на желточной оболочке куриных эмбрионов, подвергается очистке и концентрированию путем центрифугирования дифференциального и в ступенчатом градиенте сахарозы. В дальнейшем взвесь элементарных телец хламидий (содержание белка 120 мкг/мл) инактивируется 0,4-ным. формалином (конечная концентрация), смешивается с неполным адьювантом Фрейнда в соотношении 1;2 и однократно внутримышечно вводится несуягным овцам в количестве .10 мл (по 5 мл с внутренней поверхности бедра в обе конечности), Через 1 месяц после инъекции антигена овцы тотально обескровливают, отделяют сыворотку и консервируют фенолом, 3 табл,Целью изобретения являспособа получения иммунносыворотки, повышение ее акцифичности,Поставленная цель досчто несуягным овцам иликратно внутримышечно вводи концентрированные элемца возбудителя хламидиоовец после инактивациисмеси с неполным адъювантсоотношении 1:2. Через 1 мес после инъекции антигена овец тотально обескровливают,П р и м е р 1. Возбудителем хламидиозного аборта овец заражают 300 куриных эмбрионов (КЭ) в желточный мешок, КЭ, погибшие в первые 3 дня после инокуляции, выбраковывают, а погибшие на 4-10 дни вскрывают для отбора желточной оболочки.Для приготовления антигена - иммуногена используют 10-ную взвесь желточных оболочек КЭ, приготовленную на 0,2 М фосфатном буфере (ФБ) рН 1,2-1,4 путем растирания в ступке, Хламидии из 100 -ной взвеси концентрируют и очищают путем центрифугировэния дифференциального и в ступенчатом градинте сахарозы по следующей схеме;10-ная хламидийсодржащая взвесь; центрифугирование при 2500 об/мин в течение 20 мин;центрифугирование надосадочной жидкости при 18000 об/мин в течение 40 мин;гомогенизация осадка в 0,01 М ФБ рН 7,2-7,4, наслоение на 30 -ную сахарозу на 0,01 М ФБ и центрифугирование при 20000 об/мин в течение 60 мин;.гомогенизацИя осадка в 0,01 М ФБ и наслоение на ступенчатый градиент сахарозы (снизу вверх 60 о , 450 и 30%) и центрифугирование при 20000 об/мин в течение 60 мин;сбор хламидий между 45 и 30;(,-ными растворами сахарозы и отмывание в 0,01 М ФБ путем центрифугирования при 18000 об/мин в текчение 40 мин;гомогенизация осадка в 0,2 М ФБ, определение оптической плотности взвеси хламидий на спектрофотометре СФпри длине волны 280 нм и вычисление количества бела в 1 мл,Взвесь хламидий с содержанием белка 120 мкг/мл инактивируют 0,4 -ным формалином (конечная концентрация) при 37 С,в течение 5 сут, смешивают с неполным адьювантом Фрейнда в соотношении 1;2 и вводят несуягным овцам или баранам внутримышечно с внутренней поверхности бедра в обе конечности (по 5 мл в каждую сторону). Через 1 месяц после иммунизации производят тотальное обескровливание и исследуют сыворотки в РСК и РЭМА на содержание специфических хламидийных антител (табл,1),Как свидетельствуют данные табл.1, внутримышечное введение несуягным овцам какживых, таки инактивированных хламидий в смеси с неполным адьювантом Фрейндэ позволяет получить высокоактив 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ные сыворотки, Антитела к контрольному антигену, изготовленному из желтолчных оболочек неинфицированных КЭ, в хламидийных сыворотках ни в РСК, ни в РЭМА не обнаружены,П р и м е р 2. Проводились опыты с целью выяснения влияния способа введения спекцифического антигена нэ серологическую активность иммунной сы воротки.Антиген для иммунизации готовят так же, кэк и в примере 1.Смесь антигена с неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:2 вводят несуягным овцам или баранам внутрикожно вдоль позвоночника с обеих сторон (в 15 точек с каждой стороны по 0,35 мл), Общий объем введенной смеси составляет 10 мл, Через 1 месяц после инъекции антигена производят тотальное обескровливание и исследование сывороток крови в РСК и РЭМА на содержание специфических хламидийных антител (табл,2).Как видно из табл.2 внутрикожное введение хламидий в смеси с неполным эдьювантом Фрейда также приводит к выработке высокоактивных и специфических антител. Однако следует заметить трудоемкость внутрикожного способа инъекции антигена по сравнению с внутримышечными, особенно в производственных условиях,П р и м е р 3. Опыты по сравнительному испытанию предложенного способа по изобретению и по прототипу;С этой целью в качестве подопытных животных берут 3 группы по 5 голов:1 группа (п рототип) - овцы 2,5-месячной суягности, которых заражают интратрахеально и подкожно по 5 мл 20%-ной взвесью желточных оболочек КЭ, инфицированных возбудителем аборта овец, имеющей инфекционный титр в 10 КЭЛД БО/0,3 мл;2 группа (по изобретению) - несуягные овцы;3 группа (по изобретению) - бараны возраста 2-3 лет, с живой массой не менее 45 кг. Животных 2 и 3 групп иммунизируют согласно схеме по примеру 1 инактивированным возбудителем,Из 1. группы 1 овца оказалась несуягной. Иммунная хламидийная сыворотка у овец этой группы получена через 2 месяца после заражения, у животных 2 и 3 групп - через 1 месяц, Результаты излучения активности сывороток в РЭМА и РСК представлены в табл.3.Данные таблицы показывают, что предлагаемый способ позволяет изгото1779383 Формула изобретения Таблица 1 блица Таблиц Прив обратные величины титров антител..Шариповентал ставительхред М.Мо Коррект едакто екар каз 44 ВНИТираж Подписноеосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 тельский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 10 изводственн вить высокоактивную и специфическую хламидийную сыворотку и упростить технологию ее производства эа счет замены суягных овец несуягными или баранами.Технико-экономическая эффективность 5 предложенного технического решения в сравнении с прототипом заключается в замене суягных овец несуягными или баранами для получения иммунной сыворотки, необходимой для набора антигенов и сыво роток для серологической диагностики хламидиозного аборта овец и коз и набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта овец и коз и разраба тываемых наборов для выявления хламидийных антител и антигенов в РЭМА,Способ получения иммунной хламидийной сыворотки, предусматривающий однократную иммунизацию продуцентов антигеном из очищенных и концентрированных хламидий, взятие крови с последующим выделение целевого продукта, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, повышения активности. специфичности и выхода сыворотки, в качестве продуцентов используют несуягных овец или баранов, а иммунизацию проводят внутримышечно антигеном иэ иннгктивированной культуры возбудителя хламидиоза с неполным альювантом Фрейнда, взятых в объемном соотношении 1:2 соответственно,