Штамм-реассортант аренавирусов ласса и мопейя для получения иммунобиологических препаратов

СОКЭЗ СОВЕТСКИХ.СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 778176 А С 12 Б 7/00 ГОСУДАРСТВЕННО ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР ТЕНТН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ едовательи микроров АсСа чдИс, Ю. Вдг 1 че .201 о. иа- ах(54) ШТАММ-РЕАССОРТАНТ АРЕНАВИРУСОВЛАССА И МОПЕЙЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Использование: медицинская вируИзобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к разработке лецебно-профилактических препаратов.Вирус Ласса является этиологическим агентом одноименной геморрагичес" кой лихорадки. Ежегодно регистрируется 200-400 тыс. случаев этой инфекции, которая протекает с тяжелыми.: клиническими проявлениями и нередко заканчивается летальным исходом.Этот вирус является высококонта- гиозным и высокопатогенным для человека и приматов. Хорошо размножается в культурах клеток почек зеленых мар"тышек. Под агаровым покрытием образу-. сология, в частности разработка лечебно-профилактических препаратов.Сущность изобретения; штамм МЛполуцают при смешанном культивированиивирусов Ласса и Мопейя в культуреклеток с последующим клонированием.Он характеризуется следующими свойствами: размер вирионов 120-130 нм,геном - сегментированная одноцепочечная РНК. Под агаровым покрытием штаммобразует мелкие бляшки (до 0,8 мм),содержит 1.-РНК вируса Мопейя и Б-РНКвируса Ласса, является высокопатогенным для новорожденных белых беспородных мышей и слабопатогенным для мы"шей линии СВА, защищает мышей от летальной дозы вируса Ласса. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов, депонент - ГКВ Г 907.1 табл. ет бляшки со средним диаметром1,8 мм..Вирус Мопейя (ранее - Мозамбик серологически и биохимически близ родственный вирусу Ласса, но в от чие от последнего не вызывает эаб левания у человека и приматов. В культуре клеток образует бляшки ди метром до 1,5 мм. В опытах на мыш линии СОА показана высокая степен патогенности и летальности при ин цировании как вирусом Ласса, так вирусом Мопейя. Кроме того, к вир Мопейя высокочувствительны новоро денные белые беспородные мыши, це не наблюдается для вируса Ласса.Известно использование реассортантов различных вирусов в производствеиммунобиологических препаратов.Цепью изобретения является получение реассортантного штамма аренавирусов Ласса и Мопейя. для получения иммунобиологических препаратов.Это достигается при помощи смешанного культивирования вирусов Лассаи Мопей 4 в культуре клеток Чего с последующим клонированием.Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов, депонент ГКВГ 907Характеристика штамма.Название вируса, штамма; вирусыЛасса, Мопейя, реассортантный штаммМЛ.Выделен: 1989 г., Минск, в результате смешанного культивирования вирусов Ласса и Мопейя в культуре клетокЧего с последующим клонированием.Место в универсальной системе: семейство АРЕНАВИР.И,п Е,Кем выделен: СССР, БелорусскийНИИЭМ, Васючков А.Д., Фидаров Ф.МЛукашевич И.С,физико-химические свойства; размер 120-130 нм, РНК-одноцепочечная.Генетические признаки: геном сегментированный.Прочие свойства: хорошо репродуцируется в культурах клеток почек зеленой мартышки вызывает образованиебляшек под агаровым покрытием в культуре клеток Чего на 6-7 сут. Размербляшек до 0,8 мм. Высокопатогенен длясосунков белых беспородных мышей.Антигенные свойства; в тестах флуоресцирующих антител, иммуноферментного анализа отмечается специфическоевзаимодействие с иммунными поликлональными сыворотками к штаммам Джо- .-зия, Сьерра-Леоне, Мопейя, В МФА иИФМ в два раза активнее с гомологичной сывороткой, чем другие штаммы.По своим свойствам штамм МЛотличается от других штаммов сниженнойпатогенностью для мышей линии СВА иможет быть использован при разработкеаттенуированных лечебно-профилакти"ческих препаратов.Примеры, иллюстрирующие способ получения реассортантного штамма МЛ и анализ его свойств. П р и м е р 1, Клонирование вирусов Ласса и Мопейя. 5 10 15 20 25 ЭО 35 4 О Клонирование вирусов Ласса и 1 опейя проводили в культуре клеток Чего пугем троекратного пассирования из бляшки в бляшку с последующим накоплением в этой же культуре клеток. Титры исходных вирусов были равны 6,0- 6,51 р. Культуру клеток Чего выращивали в виде монослойной культуры, используя среду ВМЕ с добавлением 107; сыворотки эмбрионов коровы, Поддерживающая среда содержала 2 этой же сыворотки.П р и м е р 2. Получение урожая смешанной инфекции.Культуру клеток Чего выращивали на дне инсулиновых флаконов и после образования монослоя инфицировали смесью, содержащей равные объемы равных инфекционных доз вирусов Ласса и Мопейя из расчета конечной множественности более 1 БОЕ/клетку для каждого вируса,Адсорбция продолжалась 1,5 ч при 37 С, после чего монослой трижды отмывали раствором Хенкса и заливали средой поддержки. Зараженную таким образом культуру инкубировали 21 ч при 37 С, Затем клетки и культуральную жидкость однократно замораживали и оттаивали, После центрифугирования при 3000 об/мин надосадочную жидкость использовали в качестве исходного материала для последующего изучения.П р и м е р 3. Изоляция отдельных клонов.Вируссодержащую культуральную жидкость, полученную в результате смешанной инфекции, титровали в.культуре клеток Чего по методу Топюг 1 оЬпяоп. В качестве покрытия использовали агарозу фирмы В 1 о Рай (Е 1 есггоепйоя -новая, и = 0,13). Из агарового покрытия выкалывали бляшки, отстоящие друг от друга не менее чем на два сантиметра, Содержимое индивидуальной бляшки гомогенизировали в среде поддержки с помощью ультразвукового гомогенизатора Чг Т 1 я и использовали для заражения клеток Чего с целью последующего клонирования и накопления.П р и м е р 1, Отбор реассортантов.В качестве критериев отбора использовали вирусологические: Фенотип бляшек и летальность для сосунков белых беспородных мышей линии СВА при внутримозговом заражении животных;молекулярно"биологические: использоСрок иннунизации,кол-во дней Яоза анти гена,мл Место введений 0,5 В/мышечно+неполный адью вант фрейнда 0,5 В/брюшинно 7 21 0,5 П/кожно+полный адъювант Фрейнда 0,5 В/брюшинно Тотальный забор крови 70 5 17вание плаэмид рЛТ/Е 1.18 и рцС 1, В 7,содержащих индивидуальные участки геномных Ь- и Б-сегментов вируса Ласса,П р и м е р 5. Использование точечной гибридизации.Для постановки реакции точечнойгибридизации использовали РНК, выделенных из клеток Чего, зараженных исходными родительскими штаммами, атакже реассортантами. РНК из инфицированных клеток выделяли Фенольно-детергентным методом и наносили на нитроцеллюлозные Фильтры. РНК "прижигали" к Фильтрам в течение 2 ч при .80 С, Предварительную гибридизацию исаму процедуру гибридизации выполняли как описано Ацрег 1 г ег а 1. ОтмывкуФильтров осуществляли по методу Епйгеег а 1., при этом температура отмывкидля 1,-РНК составляла 2 ч С, а дляЯ-РНК - 56 С. Высушенные фильтры экспонировали с рентгеновской пленкой.П р и м е р б. Изучение антиген-ных свойств штамма МЛ,Антигенную активность штамма МЛ изучали с помощью непрямого методаФлуоресцирующих антител (НМФА). Используя НИФА, исследовали полученныйштамм, а также сыворотку морскойсвинки, иммунизированной этим штаммом. В качестве положительных контро"лей применяли антигены вируса Лассаи Мопейя, антитела сыворотки морскойсвинки, иммунизированной культураль;ными антигенами,из вирусов Ласса иМопейя,НИФА между штаммом МЛи гомологической сывороткой, а также сыворотками, полученными к вирусам Ласса(штаммы Джозия и Сьерра-Леоне) и Мо" 78176 6пейя, позволял наблюдать специфическую Флуоресценцию в культуре клетокЧего. Специфичность подтверждаласьотсутствием свечения при взаимодействии неиммунных сывороток с вирусом ииммунных с незараженной культуройклеток. Титр антител в сывороткахсоставлял 1:256-1:512.Специфицескую антивирусную сыворотку получали путем гипериммунизации морских свинок вирусным антигеном, представляющим культуральнуюжидкость. Схема иммунизации представ лена в таблице.П р и м е р 7. Изучение протективных свойств штамма МЛ.Для изучения протективных свойствштамма МЛиспользовали мышей ли нии СВА. У(ивотных иммунизировалидважды внутрибрюшинно с интервалом.в семь дней. Через 10 дней после последней иммунизации мышам вводили летальную дозу вируса Ласса в мозг. Жи вотных наблюдали в течение 21 дняпосле введения разрешающей дозы вируса Ласса. В течение этого периодагибели животных не наблюдалось, ШтаммМЛобеспечивал 1003 защиту мышейот летальной дозы вируса Ласса.Таким образом, поставленная цельдостигнута. Впервые удалось получитьреассортантный штамм вирусов Ласса иМопейя для получения иммунобиологических препаратов.35 формула изобретения Птамм-реассортант аренавирусов Ла 40сса и Мопейя ГКВ Р 907 для полученияиммунобиологических препаратов.