Способ определения антистрессовой активности брассиностероидов

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИСТРЕССОВОЙ АКТИВНОСТИ БРАССИНОСТЕРОИДОВ(57) Использование: физиология растений, анализ физиологически активных веществ, Сущность изобретения: определение анти- стрессовой активности брассиностероидов проводится путем воздействия на высечки иэ листьев ячменя брассиностероидов и стрессового фактора 0,3-0,5 М раствор хлорида натрия с последующим определе нием содержания пролина в высечках и листьев ячменя, обработанных и необрабо танных брассиностероидами, 1 табл,ром - повышеннои температурои и посл ющем сравнении количества образова гося белка с белком в необработанных листьях пшеницы,Недостатками способа являются невозможность его использования для определения антистрессовой активности при засолении, а также его трудоемкость иэ-эа сложности и длительности выделения белков.Цель изобретения - получение возможности определения влияния брассиностероидов на устойчивость растений к солевому стрессу и упрощение способа.Поставленная цель, достигается способом определения антистрессовой активности брассиностероидов путем осуществления контакта и биообъекта-тестера с брассиностероидом и стрессовым фактором и определения степени влияния брассиностероидов на реакцию растения, причем в качестве биообъекта-тестера используют отрезки листьев ячменя, в качестве стрессового фактора - раствор хлорида ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР юл. М 28 физиологии растений им ева, В,А.Хохлова, В.А,Хрипач (088,8)Н, и др. Брассиностероиды в еза белка в листьях пшениССР, т.305, В 5, с.1277-1279,Изобретение относится к биотехнологии, а именно к анализу физиологически активных веществ, и может бытьиспользовано для определения антистрессовой активности брассиностероидов призасолении,Известен способ определения анти- .стрессовой активности брассиностероидовпутемизмерения устойчивости проростковбобов в условиях водного стресса (Е)аоц.,ц, "ТЬе УЛет о 1 24-ер 1 Ьгазз 1 по 1 бе оп5 тегп еопдатоп апб гез 1 зтапсе соепч 1 гоп)пеТазцезз 1 п гпцпд Ьеап зеес 1 пдз".Тезисы международного совещанияв Галле (ФРГ) "Брассиностероиды-химия,биоактивность, применение", 1990, с.26).Известен способ определения анти-стрессовой активности брассиностероидовпутем определения общего синтеза. белка вусловиях повышенной температуры.Этот способ заключается в осуществлении контакта биообъекта - тестера - листьевпшеницы, предварительно обработанных брассиностероидом, со стрессовым факто 01 О 7/00; 6 01 М 21/00да, на растворе хлористого натрия, Через 24 ч определяют содержание пролина по методу Ватез (Ватез ет аГ 1973, арй бе сегапабоп о 1 аггее ргоИпе аког ча 1 ег-з 1 геез ЯтцсИез Рап 1 зо 39; 205-207). Для каждой 40 пробы берут по три отрезка и для каждого варианта проводят по три определения. Отрезки растирают в 5 мл Зо-ной сульфбсалициловой кислоты. Полученный раствор фильтруют через фильтр Сынпор М 4. 2 мл 50 фильтрата приливают в пробирку, содержа. щую 2 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл нингидрйнового красителя, который готовят по методу Ва 1 ез. 1,25 мл нингидрина разводят в 20 мл 6 М ортофосфорной кислоты и 30 мл ледяной уксусной кислоты. Пробирки с исследуемым материалом кипятятна водяной бане 1 ч. После охлаждения изнатрия, взятое количество отрезков листьев ячменя делят на четыре части, контакт первой и второй частей с раствором брассиностероида осуществляют 1,5 - 2,0 ч, контакт третьей и четвертой частей с дистиллиро ванной водой осуществляют то же время, затем вторую и четвертую части подвергают воздействию хлорида натрия в концентрации 0,3 - 0,5 М в течение 23 - 25 ч, а определение степени влияния брассиностероидов 10 на реакцию растения производят по содержанию в них пролина сравнением между собой разниц показаний между второй частью и первой, а также между четвертой частью и третьей, где пеовая и третья части 15 служат контролем.Выбор заявляемых интервалов определяется оптимизацией всех условий способа,П р и м е р 1, Растения ячменя сорта Винер выращивают в ящиках с почвой. У 20 растений в возрасте 10 - 12 дней срезают листья первого яруса. Отбирают выравненные по размеру листья, Из них вырезают отрезки длиной 2,5 см и раскладывают по 9 штук по чашкам Петри диаметром 10 см на 25 фильтровальную бумагу, смоченную 8 мл раствора брассиностероида, на 2 ч. Для каждого варианта опыта используют 3 чашки. При круглосуточном освещении исследуют набор концентраций брассиностероида 30 10 5, 10, 10 7, 10, 10 9, 10М, Контролем берут листья, инкубированные в 8 мл дистилированной воды. Через 2 ч прединкубации отрезки переносят на растворы брассино"стероида тех же концентраций, содержа щие 0,5 М йаС 1. Часть контрольных листьев переносят на 8 мл МаО. Таким образом опыт имеет три контроля: на дистиллированной воде, на растворах брассиностероимеряют оптическую плотность раствора наспектрофотометре при длине волны 522 нмпротив контрольного раствора,Пример показывает, что предлагаемыйспособ позволяет определить влияние брассиностероидов и их синтетических аналоговна устойчивость растений к солевому стрессу по снижению накопления пролина в ответна солевой стресс. Результаты представлены в таблице.Снижение содержания пролина (о отконтроля) в отрезках листьев ячменя привоздействии брассиностероидов и хлориданатрияП р и м е р 2, Проводят аналогичнопримеру 1 с той разницей, что контакт примера-тестера с анализируемым растворомосуществляют 1,5 ч, а опытный объект подвергают воздействию смеси растворов хлорида натрия в течение 23 ч, Результатыпредставлены в таблице.П р и м е р 3. Проводят аналогичнопримеру 1 с той.разницей, что контакт объекта-тестера с анализируемым растворомпроводят 2,5 ч, а опытный объект подверга-ют воздействию смеси раствором брассино- .стероидэ и хлорида натрия, либо одногохлорида натрия в течение 25 ч, Результатыпредставлены в таблице,П р и м е р 4. Проводят аналогичнопримеру 1 с той разницей, что концентрацию хлорида натрия берут 0,3 М, Результатыиспытаний представлены в таблице.П р и м е р 5. Проводят аналогичнопримеру 1 с той разницей, что концентрацию хлорида натрия берут 0,4 М.Результаты примеров показывают, чтопоявилась возможность определить влияние брассиностероидов на устойчивостьрастений к солевому стрессу при упрощении способа. Ф о рмула и зоб ретен и я Способ определения антистрессовой активности брассиностероидов путем воздействия на биологический тест-объект стрессового фактора и сравнения физиолого-биохимических показателей тест-объектов, обработанных и необработанных брассиностероидами, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве стрессового фактора используют 0,3- 0,5 М раствор хлорида натрия, в качестве тест-объекта - высечки из листьев ячменя а в качестве физиолого-биохимического показателя определяют содержание пролина,роизв Заказ 2629 ВНИИПИ Госу Тираж Подписноественного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 енно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 1