Способ определения спонтанной агрегации тромбощитов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 5. 174806 51)5 С 01 И 33/483 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ ИПРИ ГКНТ СССР ИТЕТКРЫТИЯМ О 92 ОПИ Е ИЗОБРЕТЕН ОМ К АВТ ЕТЕЛЬС Иа с 1%-ным рирова нного ным формали центрифугир полученных с личество еди тывают инд агрегации тр ле ИОСА ство тромба пробы; Ь - ко натанте 2-ой свыше 15% о гиперагрегац вации тромх 100%атов в суперн О ным результатам определяют спонтаннуагрегацию тромбоцитов,буферированным раствором хлорида на- ф трия с 1%-ным формалином с помощью ав- СО томатического счетчика клеток "Лаберскель" с последующим сопоставле- нием полученных результатови расчетом индексов обратимой спонтанной агрегации тромбоцитов, активации тромбоцитов сум- марной спонтанной агрегации тромбоципособ осуществляют следующим обра-.3 м тов.С о 0,2 мл крови, полупластиковую пронемедленно переипеткой с пластикапластиковые пробтственно по 1,8 мл ченной самотеком ирку при венопуносят автоматичеым наконечником рки, содержащие 4-5% буферировсухуюкции,ской пв трисоотве(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПОНТАННОй АГРЕ АЦИИ ТРО 1 БОЦИТОВ(57) Использование: в медицине, а именнодля диагностики и контроля заболеваний,связанных с нарушением функций ферменных элементов крови и их исследования,Цель - повышение точности исследования.Сущность изобретения; по 0,2 мл крови,полученной самотеком в сухую пластиковуюпробирку при венепункции, немедленно переносят в три пластиковые пробирки, содержащие соответственно по 1,8 мл 4-5%-ного,буферированного раствора ЭДТА - Ма, 4 -5%-ного буферированного раствора ЭДТА -Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики и контроля заболеваний, связанных с нарушением функций форменйых элементов крови и их исследования, и может быть использовано для диагностики и контроля тромбофилических состояний в гематологической, кардиологической, хирургической практике и других областях медицины.Цель изобретения - повышение точности исследования,Поставленная цель достигается путем определения количества единичных тромбоцитов в трех пробах крови с 4 - 5%-ным буферированным раствором ЭДТА - йа, 4 - 5%-ным буферированным раствором ЭДТА - Ма с 1%-ным формалином и 0,9%-ным формалином и 0,9%-ного буфе- растворахлорида натрия с 1%- ном. Пробы перемешивают и уют 60 сек, при 95 - 1009. В упернатантах определяют коничных тромбоцитов, рассчиекс обратимой спонтанной омбоцитов (ИОСАТ) по форму- а - Ьах 100%, где а - количецитов в супернатанте 1-ой личество тромбоцитов в супер- пробы и при увеличении его пределяют внутрисосудистую ию тромбоцитов, индекс актибоцитов (ИАТ) по формуле где с - количество тромбоциатанте 3-ей пробы и полученванного раствора ЭДТА - йа, 4 - 5% буферированного раствора ЗДТА - Ма с 1%-нымформалином и 0,9% буферированного раствора хлорида натрия с 10 -ным формалином (в качестве буфера используется буфер 5Михаэлиса-веренал-ацетатный, рН готовыхрастворов 7,4), Пробирки закрывают пластиковыми пробками, пробы аккуратно перемешивают (без встряхивания) ицентрифугируют 60 с (при условии, что время разгона и торможения ротора центрифуги не превышает 60 с) при 95 - 1009 (около1000 об/мин). Из среднего слоя полученныхсупернатантов берут автоматической пипеткой с пластиковым наконечником 0,02 15мл и переносят в силиконированный стеклянный стаканчик с 12,5 мл 0,90 растворахлорида натрия. Из приготовленного разведения (1:6300) после перемешивания считают тромбоциты из трех проб 20последовательно на автоматической системе "Лаборскель" при следующих параметрах: диаметр измерительного капилляра 70мк., режимы: 1 О, 70, ц, М, Устанавливаютсяпороги дискриминации; верхнй 10 В., нижний 0,4 В (подсчет тромбоцитов может производиться также любым из известныхтрадиционных методов),Производят вычисление следующих показателей, Индекс обратимой спонтанной 30агрегации тромбоцитов (ИОСЛТ): ИОСАТ =а - Ьх 1000 , где а - количество единичаных тромбоцитов из 1 пробы (4 - 5-ный буферирован н ы й раствор ЭДТА - Иа), в - 35количество единичных тромбоцитов из 2пробы (4 - 5/,-ный буферированный раствор ЗДТА - Иа с 1 -ным формалином).В норме этот показатель О - 15%, Индекс активации тромбоцитов (ИАТ): ИАТ = 40Ь - с- х 100%, Ь - количество единичныхтромбоцитов из 2 пробы, с - количество единичных тромбоцидов из 3 пробы (0,90 -ныйбуферированный раствор хлорида натрия с 451%-ным формалином), В норме этот показатель О - 5%.Суммарный индекс спонт; нной агрегации тромбоцитов (СИСАТ): СИСЛТ =а 50х 100= =ИОСАТ + ИЛТ. В норме этотпоказатель О - 20 ,П р и м е р 1. Больная У., 35 лет, историяболезни 3567, поступила в реанимационноеотделение РКГИОВ 29.10.1988 г, с диагнозом токсико-аллергический васкулит, осложнившийся ДВС-синг.ромом. Из веныбольной была взята кровь по 0,2 мл в 7пластиковых пробирок, содержащих по 1,8мл буферированного раствора с онцентрацией ЭДТА - йа соответственно: 0,5, 1;О, 2,0, 3,0, 4,0, 6,0, 5,.0% в 7 пластиковых г 1 робирок, содержащих по 1,8 мл буферированного раствора ЭДТА - Ма в вышеуказанных концентрациях с 1 -ным формалином и в пластиковую пробирку с 1,8 мл 0,90 -ного буферйрованного раствора хлорида натрия с 1%-ным формалином, Пробы были отцентрифугированы 60 с при 1009. Затем на автоматической системе "Лаборсколь" были подсчитаны единичные тромбоциты из среднего слоя полученных супернатантов, Наибольшее количество единичных тромбоцитов определено в пробах с концентрацией ЭДТА - Ма 4 и 5(210 ": 5 х 10 /мкл), что свидетельствует о наиболее выраженном анти- и дезагрегационном эффекте препарата в данных концентрациях. В пробах с концентрацией ЭДТА - Ма меньше 4% количество единичных тромбоцитов было меньше 210 + 5 х 10 /мкл и снижалось по мерезснижения концентрации ЭДТА - Иа в растворе, что свидетельствует о недостаточном анти- и. дезарегационном эффектах препарата в исследованных концентрациях, При увеличении концентрации ЗДТА - Ма в растворе до 6% количество единичных тромбоцитов снизилось до 180 + Зх 10 з/мкл, что связано с повреждающим действием высоких концентраций ЭДТА - Ка в растворе на тромбоциты. Аналогичная динамика содержания единичных тромбоцитов наблюдалась и во второй серии проб крови, стабилизированных указанными концентрациями ЭДТА - йа с добавлением 1% формалина, т.е. самое высокое их содержание определялось в йробах второй серии (ЭДТА - Ма с 1%-ным формалином) с концентрацией ЭДТА - йа 4 и 5% и было достоверно ниже, чем в пробах первой серии (ЭДТА - Ма) с соответствующими концентрациями ЭДТА - йа без формалина - 110 +зЗх 10 /мкл. Количество единичных тромбоцитов.в пробе, стабилизированной в 0,9%- ном буферированном растворе хлорида натрия с 10 -ным формалином, составило 95 +4 х 10 /мкл, Был произведен расчет индексов,Индекс обратимой спонтанной агрегации тромбоцитов (ИОСАТ) по формуле:ИОСАТ=х 100% 210-110 х 1000/21047,6 , что более чем в три раза большснормы (О - 15%),Индекс активации тромбоцитов (ИАТ)по формуле: ИАТ = -- . - х 1000/,110 - 95- х 100= 7,1 , что превышает норму почти в 1,5 раза (О - 5%).Суммарный индекс спонтанной агрегации тромбоцитов (СИСАТ) по формуле: СИСАТ = х 1000= ИОСАТ+ ИАТ =а=47,6+ 7,1 =- 54,70 , что более чем в 2 раза превышает норму (О - 200 ).В приведенных формулах а - количество единичных тромбоцитов в супернатанте 1 пробы, в - количество единичных тромбоцитов в супернатанте 2 пробы, с - количество единичных тромбоцитов в супернатанте 3 пробы,Таким образом, у больной был диэгносцирован гиперагрегационный синдром с высоким риском тромботических.осложнений, что послужило основанием для назначения антиагрегантов, При последующем контроле на фоне проводимой антиагрегационной терапии ИОСАТ снизился до 25,3 , ИАТ - до 5,3%, СИСАТ - до 30,60 ,При исследовании контрольной группы доноров из 110 человек от 20 до 45 лет были проведены описанные исследования и установлено, что наибольшее количество единичных тромбоцитав определяется в буферированных растворах с 4 - 50 -ной концентрацией ЭДТА - Иа в растворах с той же концентрацией ЭДТА - Иа с 10 -ным формалином количество единичныхтромбоцитов достоверно меньше, в 0,90 -ном буферированном растворе хлорида натрия с 1%-ным формалином - еще меньше. При проведении сравнительных расчетов были установлены три описанных индексаи определены границы их нормальных показателей: ИОСАТ от О до 15 , ИАТ - от О до 50 , СИСАТ - от 0 до 20%.П р и м е р 2. Больной А 17 лет, история болезни 2987, поступил в гематологическое отделение РКГИОВ 03.09.1988 г, с диагнозом геморрагический васкулит, кожно-суставная форма, Из вены больного была взята кровь по 0,2 мл в 3 пластиковые пробирки с 1,8 мл растворов соотве"ственно: 1 - с 5%- ным буферированным раствором ЭДТА - йа 2 - с 5%-ным буферированным раствором ЭДТА - Ма с 10 -ным формалином и 3 - с 0,9%-ным буферировнным раствором хлорида натрия с 1%-ным формалином. Пробы были отцентрифугированы 60 с при 1009.Затем нэ автоматической системе "Лаборскель" было подсчитано количество единичных тромбоцитов из среднего слоя5 полученных спренатантов. Определено; в 1пробе 325 х 10 /мкл тромбоцитов, во 2 пробе310 х 10 /мкл тромбоцитов, в 3 пробез260 х 10 /мкл тромбоцитов. Были рассчитаз0 ны индексы: ИОСАТ= 3 х 100=325 - 310=4,6%, ИАТ = х 1000=15,40 иСИСАТ =325 - 260325х 100% = 20 . Таким15 образом, ИОСАТ и СИСАТ находились впределах нормы, а ИАТ, свидетельствующий о высокой потенциальной гиперагрегационной способности тромбоцитов, болеечем в три раза превышал норму. Получен 20 ные результаты послужили основанием дляназначения больному антиагрегационнойтерапии, При последующем контроле описанным способом на фоне антиагрегационной терапии ИОСАТ и СИСАТ оставались в25 пределах нормы: 4,50 и 11,4 соответственно, а ИАТ снизился до 6.90 ,Формула изобретенияСпособ определения спонтанной агрегации тромбоцитов, включающий взятие30 пробы крови, внесение ее в две пробирки,добавление в первую пробирку стабилизатора ЭДТА - Ма, во вторую - ЭДТА - Ма и10 -ный раствор формалина, центрифугирование с последующим подсчетом в суперна 35 танте количества единичных тромбоцитов,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения точности способа за счет расширения его информативности, дополнительно пробу крови вносят в третью пробирку,40 куда добавляют 0,90 -ный раствор ЙаС иформалин, в каждую пробирку добавляютбуферный раствор для создания рН 7,4, приатом стабилизатор добавляют в виде 4 -5 -ного раствора, затем подсчитывают ко 45 личество единичных тромбоцитов в каждойпробирке с последующим расчетом индексов обратимой спонтанной агрегации. активации и суммарной спонтанной агрегациитромбоцитов и по полученным результатам50 определяют спонтанную агрегацию тромбоцитов.