Способ определения антител к катехоламину

. гяд 1 ь(Р Й -ф,АВТОРСКО ВИДЕТЕЛЬСТ Я АНТИТЕЛ К е- ия ариант, при котором ют в воде, в раствор ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ И(71) Таджикский государственный университет им. В.И. Ленина и Институт сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИ КАТЕХОЛАМИНУ(57) Изобретение относится к химии получ ния новых соединений для их использован в технике иммунохимических иследований Цель изобретения - повышение чувствительности к катехоламину, Для этого в раствор пероксидаэы в воде добавляют катехоламин и глутаровый альдегид в молярном соотноИзобретение относится к химии получе, ния новых соединений для их использования в технике иммунохимических исследований. Цель изобретения - повышение чувствительности способа при определении титров антител к катехоламину.Способ осуществляют следующим образом.В раствор пероксидазы в воде добавляют катехоламин и глутаровый альдегид в молярном соотношении компонентов 1;100:8 - 16 соответственно, смесь инкубируют при 20 - 30 С в течение 3 ч, после чего выделяют целевой продукт диализом против воды.Возможен е впероксидазу ря шении компонентов 1:100:(8-16). Смесь инкубируют при 20 - 30 С в течение 3 ч, затем выделяют целевой продукт диалиэом против воды. Для повышения чувствительности способа твердую фазу сенсибилиэируют вторичными антителами, их подвергают взаимодействию с исследуемой сывороткой при 37 С 40 мин, затем твердую фазу промывают водой, добавляют меченый пероксидаэой катеэоламин в разведении 1:100, Перед коньюгированием ферментномеченого катеэоламина пероксидазу хрена активируют периодатом натрия при молярном соотношении 1:(1 50-200), выдерживают 30 - 40 мин и используют в соотношении катехоламином 1:200, Реакционную смесь инкубируют 40 мин при 37 С, промывают водой, добавляют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определяют титр антител. 2 з.п; ф-лы. добавляют перйодат натрия в количестве а 150 в 2 М на 1 М пероксидазы, реакцион- О ную смесь инкубируют 30 - 40 мин, диализуют (Л против воды, после чего в ней растворяют О катехоламин в количестве 200 М на 1 М пероксидаэы, инкубируют при 20-30 С в течение 3 ч, а затем выделяют целевой про- Цф дукт диалиэом против воды.ЖДля повышения чувствительности способа определения титров антител к катехоламину путем обработки иммобили-зованного на твердой фазе комплекса антиген-антитело ферментсодержащим биологически активным веществом. взаимодействия с субстратной смесью и последующего определения титра антител по интенсивности окраски, твердую фазу сенсибилизируют вторыми антителами, их под 1656455вергают взаимодействию с исследуемой сывороткой при 37 С в течение 40 мин, после чего твердую фазу промывают водой и к ней добавляют меченый пероксидазой катехоламин в разведении 1;100, реакционную смесь инкубируют 40 мин при 37 С, промывают водой, добавляют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определяют титр антител.Согласно способу определения катехоламинов, антитела к катехоламину сенсибилизируют на твердой фазе, затем к иммобилизованным антителам добавляют исследуемую пробу, инкубируют при 37 С в течение 40 мин, отмывают водой, после чего к образовавшемуся комплексу добавляют меченый пероксидазой катехоламин, инкубируют при 37 С в течение 40 мин, промывают водой, добавляют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определяют количество катехоламина в исследуемой пробе.,По первому способу катехоламин связывается с пероксидазой при помощи бифункционального реагента - глутарового ал ьдегида.П р и м е р 1, Получение меченого пероксидазой норадреналина 0,1 мкМ пероксидазы растворяют в 2 мл воды, добавляют в раствор 10 мкМ норадреналина и по каплям 2 мл раствора, содержащего 0,8 мкМ глутарового альдегида. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч, а затем подвергают диализу против воды на диализной мембране 20/32 фирмы Яегна (ФРГ) в течение 24 ч.Для сенсибилизации поверхности полистиролового планшета используют вторые антитела, в качестве которых применяютдб морской свинки к дб кролика, в концентрации 20 мкг/мл в 0,1 М карбонатбикарбонатном буфере рН 9,6, В каждую лунку планшета вносят по 50 мкл раствора вторых антител и инкубируют в течение 18 ч при 4 С, после чего лунки промывают водой с добавлением твинафирмы "ГегаК" (Западный Берлин), Затем в каждую из лунок вносят антисыворотку к определяемому катехоламину в двукратных разведениях (по 50 мкл), начиная с разведения 1:200, инкубируют в течение 40 мин при 37 С, затем отмывают водой с твином и вносят в каждую из лунок по 50 мкл меченого пероксидазой катехоламина, вид которого соответствует определяемому типу антител, в разведении 1:100. Смесь инкубируют в течение 40 мин при 37 С, после чего планшеты отмывают водой с твиноми добавляют в каждую из лунок по 50 мкл субстратной смесисостоящей из 5 мл рас в течение 3 ч при комнатной температуре, азатем диализуют против воды на диализной30 мембране 20/32 фирмы "Яегна" (ФРГ) в течение 24 ч,Определение титра антител проводяткак в примере 1,Препарат, синтезированный по перво 35 му способу, содержит большее количествокатехоламина, присоединенного к пероксидазе (6-8 М на 1 М пероксидазы), чемпрепарат, полученный по второму способу(3 - 4 М на 1 М пероксидазы), В то же время40 препарат, полученный по второму способу,обладает большей ферментативной активностью (2 10 М против 5 10 М). Изпрактических соображений предпочтение киспользованию одного из препаратов от 45 дать затруднительно, так как качественные параметры их примерно одинаковы.Отсюда следует. что первый и второй способы получения являются альтернативными,50 Основным критерием оценки свойствполученных препаратов служит определение связывающей способности антител ккатехоламинам по отношению к этим и репаратам,55 Для сравнения производят определение титров антител прототипным способом,при котором полис 1 ироловыи планшет сенсибилизируют соответствующим катехоламином, а образовавшийся комплекскатехоламин - антитело индентифицируют 5 1015 2025 твора ортофенилендиамина (0,4 мг/мл) в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере рН 5,0 и 20 мкл 3%-ной перекиси водорода. Послеинкубации в течение 5 мин ферментативную реакцию останавливают 50;-ным раствором серной кислоты, Оптическую плотность раствора в каждой лунке регистрируют на многоканальном фотометре РР, фирмы "1 аЬзузтещз Оу" (Финляндия).при 500 нм.По второму способу углеводную часть пероксидазы предварительно подвергают окислению перйодатом натрия и активированный таким образом фермент вступает в реакцию с катехоламином.П р и м е р 2, Получение меченою пероксидазой норадреналина.0,2 мкМ пероксидазы растворяют в 1 мл дистиллированной воды, Затем к этому раствору добавляют 0,2 мл раствора, содержащего 30 мкМ перйодата натрия, перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре и диализуют против воды. 40 мкМ норадреналина растворяют в 1 мл фосфатного буфера рН 7,2 и добавляют к раствору окисленной перйодатом пероксидазе. Смесь перемешивают1656455 Составитель А. ЛитовченкоТехред М.Моргентал Корректор С. Шевкун Редактор А. Ревин Заказ 2049 Тираж 419 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж. Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 вторыми антителами, мечеными пероксидаэой. По данным измерения оптической плотности построены зависимости в координатах - оптическая плотность против фактора разведения антисыворотки: при 5 определении известным способом и предлагаемым способом. В известном определении: при разведении антител 1:3200 и выше оптическая плотность не изменяется и равна 0,17. В предлагаемом определении это зна чение оптической плотности достигается при разведении 1:891.200 и выше. Это говорит о том, что образовавшийся комплекс катехоламин-антитело выявляется в предлагаемом способе в 256 раз чувствительнее, чем 15 в прототипном. Таким образом, применение меченого пероксидазой катехоламина в предлагаемой схеме определения титров позволяет повысить чувствительность определения более чем в 200 раз. 20 Формула изобретения1. Способ определения антител к катехоламину, включающий сенсибилиэацию твердой подложки, добавление исследуе мой сыворотки,.ферментспецифического субстрата и определение количества антител" по развитию специфического окрашивания, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения чувствительности способа, твердую подложку сенсибилиэируют вто- ричнымИ антителами и после добавления исследуемой сыворотки вносят ферментномеченный катехоламин, приготовленный путем его конъюгирования и инкубирования в течение 3 ч при комнатной температуре с последующим диализом. 2, Способ поп.1, отлича ющийся тем;-. что при коньюгировании ферментномеченного катехоламина используют катехоламин, пероксидазу хрена и глутаровый альдегид в молярном соотношении 1:100:8-16.3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что перед коньюгированием фермент-но-меченного катехоламина пероксидаэу хрена активируют перйодатом натрия, взятых в малярном соотношении 1:150-200, выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре и используют в соотношении с катехоламином 1:200.