Способ определения токсичности химических веществ

,ЯО, 15645 А О 01 И 33/18, 33/00 АНИЕ ИЭОБРЕТЕНИ г:г логических исследования. Цель изобретения - повышение чувствительностии упрощение технологического процесса. Для этого воздействуют исследуемым веществом на дрожжи, при этомиспользуют штамм Яассйагащусез сегечхзае 15 В-П 4, культивирование которого пРоводят на жидкой питательнойсреде, содержащей соль двухвалентного железа, с последующим переносомклеток штамма в аэрируемый растворосфата калия и выдерживают их в растворе до ;кисления накопленного дрожжами ферро-железа. После окисленияклетки переносят в тестируемыйраствор и по степени подавления Ферриредуктазной реакции определяют токсичность исследуемого вещества.1 табл. дой и вносят в интенсивно аэрируе раствор КНРО+ на 1,5 ч для окисл ния накопленного дрожжами ферро-ж леэа. Затем клетки осаждают и пер носят в среду, содержащую КНР 04глюкозу (контрольный вариант), а же исследуемое вещество в нужных центрациях (опыт). В начале и в це 3-часовой инкубации определяюие двухвалентного железа в л я к ко ие относ ием окру рименени медико-б Изобрет за загрязн жет найти ающей сре в водной их ислогичес огии акдержан клеткаИнк объемо ном ва аккуму же вар ят в пробиркахэтом в контрольвосстанавливают ацию10 мланте провоПри дрржж ное ж рованте лезо, в опытн давляетсясимости от госуаа ственный комитетпО изОБРетениям и ОткРытиямПРИ ГКНТ СССР Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете(72) Л.М.Ковалев, Ю.П.Козлов, М.А;Хабадаева и В,М.Янова (53) 615.9.576.8.097,29(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР У 1097947, кл. С 01 И 33/18, 1983.Авторское свидетельство СССР У 1010557, кл: С 01 И 33/18, 1981. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ(57) Изобретение относится к области контроля за загрязнением окружающей среды и может найти применение в водной токсикологии при медико-биоследованиях.Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение технологического процесса.Для этого клетки штамм ЯассЬагащусев сегеу 1 э 1 ае 15 В-П 4, взятые в экспоненциальной Фазе роста, переносят в свежую питательную среду, содержащую глюкозу, КНРО , дрожжевой автолизат, 0,5 Х желатины и 2 ммоль/л соли Мора (ГеБО+" (ИН 4)804 10 Н О). После. 3-часовой инкубации клетки осаждают центрийугированием при 20008, дважды отмывают дистиллированной ворриредуктазная реакция ксичным веществом в зя го концентрации, Поснижению скорости восстановления аккумулированного железа судят о токсичности исследуемого вещества.Содержание двухвалентного железав клетках определяют следующим образом,Культуральную жидкость центрифугируют при 2000 я. К осадку быстро,.приливают 0,05 М водный раствор2,2 -дипиридила, тщательно перемешивают, добавляют 10 мМ раствор МдЯ 04встряхивают, снова центрифугируютпри 2000 я, К осадку приливают смесьацетона и 10 мМ раствора МдЯ 04 (1:1,Ч:Ч), встряхивают, снова центрифугируют. Затем определяют в супернатантеконцентрацию Ре(дару) ф по оптической плотности при 522 ни, Далеерассчитывают скорость восстановленияжелеза как разность концентрацийдвухвалентного железа в конце и в начале инкубации, деленная на времяинкубации и плотность клеток.П р и м е р. Влияние нитрита натрия (ИаНО) и МаЯ 1 Р 6 (гексафторосиликата натрия) на восстановлениежелеза.Клетки штамма Я, сегеч 1 зае 15 В-П 4выращивают на полной жидкой питательной среде, осаждают центрифугированием при 2000 я, вносят в среду, содержащую 2 Е глюкозы, 0,2 Е КНР 04,дрожжевой автолизат (20 мл/л), 0,5 Ежелатины и 2 ммоль/л соли Мора. После 3-часовой инкубации клетки осаждают центрифугированием, дважды отмывают от среды дистиллированной водой,переносят в интенсивно аэрируемыйраствор КНдР 04 на 1,5 ч для окисления накопленного дрожжами ферро-железа, После окисления клетки осаждают и вносят в среду, содержащую 0,2 ХКНРО и 27 глюкозы - это контрольныйвариант. Затем пипеткой разливаюткультуральную жидкость по 10 мл встеклянные пробирки, в которые предварительно вносят концентрированныерастворы (или навески) ИаИО (в других опытах ИаЯРа), Определяют содержание двухвалентного железа в 50клетках в начале инкубации. 2 млкультуральной жидкости центрифугируютпри 2000 я, К осадку ( - 10 мг сухоговеса) быстро приливают 1 мл 0,05 Мраствора 2,2 -дипиридила. Тщательно 55перемешивают, добавляют 4-5 мл 10 мМраствора МяЯО 4, встряхивают, сновацентрифугируют при 2000 я. К осадку приливают 2 мл сиеси ацетона и 10 мМраствора МяЯО, встряхивают, сновацентрифугируют. Затем определяют всупернатанте концентрацию Ре(йру) "по оптической плотности при 522 нм,3Инкубацию проводят в термостате,при й = 30 С, В конце 3-часовой инкубации определяют содержание двухвалентного железа в клетках. Скоростьвосстановления железа рассчитываюткак разность концентраций двухвалентного железа в. культуре через 3 чи в начале инкубации, деленная на180 мин и плотность клеток,В таблице приведена скорость восстановления аккумулированного железав присутствии токсикантов и в контроле,Нитрит натрия в концентрациях210 4 -5 10 4 моль/л незначительно,а в концентрации 10" моль/л в 4 разаснижает скорость восстановления жеглеза, в концентрации 1,5" 10М полностью подавляет железо-восстановительный процесс. Гексафторосиликатнатрия (ИаЯгР) снижает скоростьвосстановления железа вдвое в концентрации 10 4 М, в 16 раэ - в концентрации 210 М, а 4 10 М полностьюподавляет восстановление железа,Таким образом, предлагаемый способпозволяет оценить влияние исследуемого вещества на физиологическое состояние клетки, определить токсичныеконцентрации с достаточной степеньючувствительности (до 10моль/л),.Формула изобретенияСпособ определения токсичностихимических веществ, включающий культивирование штамма ЯассЬагашусез сегеч 1 зае 15 В"П 4, на жидкой питательной среде воздействие на него исследуемого вещества с последующей оценкой полученных резулЬтатов, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения чувствительности и упрощения технологии, культивирование штамма проводят на питательной среде,содержащей соль двухванентного железа, затем выделенные клетки инкубируют в аэрируемом растворе фосфатакалия до окисления аккумулированногоферрожелеза, после этого клетки переносят в тестируемый раствор, а оценкупроводят по степени подавления ферриредуктаэной реакции,1564539 Токсикант Концентрациятоксиканта,моль/л Скорость восстановления железа, нмоль сухой вес, гминГ КонтрольИаЮ КонтрольИа аВЫб Составитель С, ПыловаТехред Л. Сердюкова Корректор С.Шекмар Редактор Т.Парфенова Заказ 1156Подписное Тираж 525 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5