Способ определения морозоустойчивости пшеницы

(51) 1" . ь 1 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 ь.н 47 но в селекции пшемороз оустойчивыхбрете ния - поньшеи точности при соопределения мороз дан ницы при со сортов. Цел ние достове зо ность ращении вчстойчивььх мен раст нии, Раст вергают о ответствую поми, сой фазамных акаливани еристем г парать рашенные ют соотн де- леочного ци табл. носи быть+ 8) и чувствь льной к д азе (Г )чивос тииз Изобретение отннологии, в частносскохозяйственных р ериментальной ств осится к тех сел сте судя ких температур ф пени морозоустоь Важным момент выбор в качестве ния апикальной мти селекцииастений, абиологии идля определпшеницы,я - повышен такж а является ом споса объекта можетения эксп быть следо льзовано ойчивост пи стемы побег оэоу ель е чут еристема побегаует на снижение кальна и обретени и и точн емпера которы ко реаги ры по ср естестве а ости анали ремени опр стоверн также с ению с корн л ращение иях находится в чувствительнос нных у с.оэтому ния,е зе ратуры невысока.ма побега являетс на ни ая мер асреди образовательных обеспечивает морфоге главно ней, о й ифференцировку ткане еточный цикл. Измене стения,лирует крис тур о стояния апик альноьь ть критерием степерастений. може ойчиво При ерируюолиизких температурахих клеток затормажи и по с ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии(56) Авторское свидетельство СССРУ 967392, кл. А 01 Г 7/00, 1982.(54) С 110 СОН 011 РЕДЕЛЕНИЯ МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ(57) Изобретение от тся к биотехнологии и может испольэоваСпособ включает проращивани рновок, воздействие низкой температурой и цитофотометрический анализ на содержание ДРК в ядрах меристемы, при этом на четырехсуточные проростки последовательно воздействуют пониженной температурой +4 и -4 С, затем выделяют апикальные меристемы побегов, окрашивают их по Фельгену, готовят давленые препараты, проводят цитофотометрический анализ при 550 нмоотношению количества ДНК в ус - тойчивых фазах клеточного цикла (С, + Я 01528395 ия последовательн аботке температур щими первой и втор затем иэ апикал товят давленые пр по Фелы ену, и оп шение ДНК и фазах ла С + 8 и фаз 1ь побега при снижении темп1528395 15 30 40 цжизненные процессы, наблюдается за-тухание деления, основная массаклеток находится н интерфазе - наиболеа продолжительной фазе митоти 5ческог о цикла. Интегральную оптическую плотность окрашенных по Фельгену ицтерфазцых ядер измеряют в трехфазах: н пресинтетической фазе (С,),н которой идет подготовка клеткик синтезу 1 К; в синтетической фазе(8), когда осуществляется синтезДНК; н постсинтетической фазе (С),нечецие которой клетка переходитк делению.Ядра соматических клеток предсинтетической фазы характеризуютсядиплоидцым количеством ДНК (2 С),ядра п Фазы - тетраплоидным количеством ДНК (4 С), ядра синтетической фазы - промежуточным количеством Д 1 К (2 С - 4 С).Критерием диплоидного количестваДНК служат телофазные ядра, находящиеся В процессе деления которые 25содержат 2 С г 1 НК, а тетраплоидногометафазные ядра, содержащие 4 С ДНК.Учитываются как наибЬлее устойчивые Фазы - предсинтетическая исинтетическая (Сг и 8), так и самаячувствительная постсинтетическая(С ) (Гродэинский 1,М., Хилько Т.Д;,Белецкая Е.К. Критика клеточной популяции меристемы стебля озимой пшеницы после действия отрицательнойтемпературы, - В кц,; Клеточный 35цикл растений, Киев, 1983),Выбор пониженных температур ннаших опытах соответствует прохож дению растениями 1 Фазы закаливания (+4 С) и 1 фазы закаливания(-4 С) в естественных условиях.Способ осуществляют следующимобразом,Зерцовки разных сортов пшеницы,различающихся по степени морозоустоичиности, гтроращивают при 20 С, а затем последовательна ныдерживают при4 и -4 С. После прохождения цикланизких температур из проростков выделяют 8-10 меристем побега и Фиксируют их н смеси этанол-уксуснаякислота. Образцы подвергают гидрогцгзу н 1 ц.НГ 1, окраппгнают реактивомШиФфа (Фуцсицсерцистая кислота), который взаимодействует с ДНК, образуяокрашенный н густо-Фиолетовый пнеткомплекс,НК-Фуксин, по содержаниюкоторого н ядре судят о суммарном количестве,ПК,Интегральную огти гескую плотность окрашенных ядер измеряют на сканирующем цитоспектрофотометре СМП.Для анализа отбирают 60-70 ядер в каждом варианте. Коэффициент мороэоустойчивости рассчитывают как отношение количества ДНК в ядрах в фазах С, и Ы к их количеству в фазе С.Выбранный режим проращивания можно обосновать следующим образом. На четвертые сутки в апикальной меристеме побега наблюдается наибольшее количество митозов (делящихся клеток), у трехсуточных проростков митоз наблюдается, но в очень незначительной степени и на давленых препаратах почти це виден, у пятисуточных проростков наблюдаются следующие волны митоза и помимо удлинения сроков анализа, что нецелесообразно, падает также достоверность получаемых результатов.Кроме того, температурный режим и режим проращивания выбран в соответствии с фазами закаливания, Пергая фаза закаливания находится в интервале 0-6 С, вторая - -2 до -5 С.оТемпературный режим и время вьгдержки установлены эмпирически. П р и м е р ы 1-4, Зерновки сортов озимой пшеницы - Ульяновка (нысокоморозоустойчивый сорт), Мироновская 808 (морозоустойчивый сорт), Карлик краснодарский (среднеморозоустойчиный сорт), Московская 35 (неморозоустойчивый сорт) - проращивао ют последовательно 4 сут при 20 С, затем 4 сут при 4 ОС, 2 сут при -4 Сои 1 сут при +4 С, После прохождения цикла поцижающихся температур из проростков выделяют клетки апикальцой меристемы побега и фиксиругот их в смеси этанол-уксусная кислота (3: 1)ог течение 3 ч при 4 С. Материал проводят последовательно через серию сп.гртов различной концентрации до воды 70, 50, 307, вода). Образцы подвергают гидролизу в 1 н,НС 1 в те-гецие 40 мин при 50 С, окрашиваютореактивом Шиффа (при 4 С в течение б ч), получая при этом окрашенные в густо-фиолетовый цвет комплексы ДНКФуксина, Не вошедший в реакцию краситель отмывают в свежих сернистых водах, обрабатывают 0,2 Е-ным раствором целлюлизина для удаления клеточных оболочек, мацерируют в 403-ног уксусной кислоте и готовят постоянныеСуммарное содерхание ДНК-фуксина в ядрах апнкальной мернстемы побега в эависнмости от сорта и коэффициента мороэоустойчивости одерхание ДНКавах клеточносл. ед. Сорт Коэффициент мороэоустойчивостн Степень мороустойчнвост арное ина в о пред- агаемопо сравниваемомуспособу о авт, 96739 му способу Высокомороэоустойчнвый сортМороэоустойчивый сортСреднемороэо- Устойчивый 43,2464,75 3237132425701283 10,3810,83 13,86124 1391111 08-098 УльннлнМироновская808Карлик крас"нодарскнй,0 сорт Немороэоусто чивый сорт сковскал 35 2099 ьг 1,67 а 370 06"0 16- 17 1,3 5 152839 препараты с помощью жидкого азота и бальзама.Интегральную оптическую плотность окрашенных ядер измеряют на сканирующем цитоспектрофотометре СПМ-ОЗ. Коэффициент мороэоустойчивости рассчитывают как. отношение количества ДНК в ядрах в фазах С, и Б к их количеству в фазе Сг.10Полученные данные представлены в таблице.Для доказательства существенности режима выращивания проростков проведены сравнительные опыты 5-7 в кот 15 торых используют режим выращивания по прототипу. П р и м е р ы 5-7 (сравнительные), Зерновки пшеницы сортов Мироновская 808 Безостая 1, Московская 35 про ьо ращивают раздельно 10 сут при 4 С и 27 ч при 20 С. Отделяют кончики корешков (1-1,5 мм) и далее следуют методике, приведенной в примерах 25 1-4 . КоэффициенТ мороэоустойчивости рассчитывают по отношению содержания ДНК в ядрах клеток, выращенных при 20 и 4 С.Полученные данные представлены в таблице.Предлагаемый способ позволяет более четко разделять близкие по морозоустойчивости сорта (морозоустойчивый сорт Мироновская 808 отличается от высокоморозоустойчивого сорта 35 Ульяновка в 1,7-1,8 раза, тогда как по известному способу это различие составляет всего 0,1); сократить время проведения анализа и объем исследуемого материала (по сравнениас способом-прототипом) более чемвдвое, так как для вычисления коэффициента морозоустойчивости используют растения одного режима выращивания вместо двух. Достоверность определения повьпнается эа счет того,что для анализа берется апикальнаямеристема побега, фазовое состояниекоторой более специфично на влияниенизких температур чем у корневоймеристемы. Формула изобретения Способ определения морозоустойчивости пшеницы, включающий проращивание эерновок, воздействие низкой тем - пературой, цитофотометрический анализ на содержание ДНК в ядрах меристемы, отличающийся тем, что, с целью повьпаения точности и достоверности анализа, а также сокращения времени определения, на четырехсуточные проростки последовательно воздействуют пониженной температурой, соответствующейтемпературам первой и второй фаз закаливания, затем выделяют апикальные меристемы побегов, окрашивают их по Фельгену, готовят давленые препараты, проводят цитофотометрический анализ при длине волны, соответствующей максимальному поглощению излучения реактива Шифа и по соотношению количества ДНК в устойчивых фазах точного цикла и чувствительной к действию низких температур фазе судят о степени морозоустойчивости.