Способ выделения бактериальной днк

(71) Всесоюзный наский противочумный(54) СПОСОБ ВЬ 1 ДЕЛЕН 1(б 43 учно-исследователь институт "Микроб" .Т.Можаров Е., М Тпшпп. гпэ В.п Гесс.371-376.,ИЯ БАКТЕР Н ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕПЬСТ(57) Изобретение относится к областимолекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в генно-инженерных работах и бактериологических исследованиях. Целью изобретения является упрощение способа вьделения ДНК из бактериальных клеток,улучшение качества целевого продуктаи повышение безопасности работы спатогенными микроорганизмами. Основное отличие предложенного способа состоит в том, что весь процесс выделения ДНК проводят в один этап в закрьгтой центрифужной пробирке. После одномоментной загрузки всех компонентовне требуется никаких манипуляций слизатом вплоть до сбора целевого продукта. Этим достигается сокращение числа операции в ходе процедуры вьделения, а также уменьшение времени контакта исследователя с исходным материалом. Принципиально важным метоФдическим приемом, обеспечивающим возможность одноэтапного вьщеления ДНК, является способ внесения бактериальных клеток в центрифужную пробирку. Материал помещают между двумя слоями лизирующей смеси, нижний из которых наслоен непосредственно на поверхность раствора хлористого цезия. Предложенный метод лизиса клеток позволяет отказаться от перемешивания лизата и предотвратить повреждающие гидродинамические воздействия на ос- Я вобождающиеся молекулы ДНК, а также обеспечивает попиое освобовдеиие ДНК Щ иэ связи с РНК и белком, Вследствие этого целевой продукт содержит меньше повреждений и в меньшей степени, ф чем в случае использования известного способа, загрязнен примесями, Благодаря тому, что полнота лиэиса в данном случае может регулироваться путем изменения времени контакта клеток с лизирующей смесью, изобретение ЦР может быть использовано не только Фаад для получения плазмидной ДНК, но и для вьделе(ия хромосомного материала. )ф), 2 з.п. ф-лы.Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в генно- инженерных работах и бактериологичес 5 ких исследованиях.Целью изобретения является упрощение способа выделения ДНК из бактериальных клеток, улучшение качества целевого продукта и повышение безопас ности работы с патогенными микроорганизмами.По предлагаемому способу весь процесс выделения ДНК проводят в один этап в закрытой центрифужной пробир ке. После одномоментной загрузки всех компонентов не требуется никаких последующих манипуляций с лизатом вплоть до сбора целевого продукта. Этим достигается сокращение числа операций в 20 ходе процедуры выделения целевого продукта, а также уменьшение времени контакта исследователя с исходным материалом, что приобретает особое значение при использовании для выде ления ДНК патогенных штаммов.Бактериальные клетки вносят в центрифужную пробирку между двумя слоями лизирующей смеси, нижний из которых наслоен непосредственно на 30 поверхность раствора хлористого цезия. Этим достигается мягкий и глубокий лизис, при котором ДНК полностью освобождается иэ клетки и легко отделяется от прочих продуктов деструкции З 5 клетки при последующем ультрацентриАугировании Такое внесение материала позволяет отказаться от перемешивания лиза та и предотвратить повреждающие гидродинамические воздействия на освободившуюся ДНК. В результате применения указанного методического приема получаемый продукт содержит меньше по.45 вреждений и в меньшей степени, чем в случае использования известного способа, загрязнен примесями ДНК и белкаПредлагаемый способ позволяет регулировать полноту лизиса путем изменения времени инкубации клеток с лизирующей смесью, а следовательно, в отличие от известного может быть использован не только для получения плаэмид, но и для выделения хромосомной ДНК, Дополнительное обогащение продукта нужным типом ДНК (хромосомной или плазмидной) осуществляется за счет изменения температурногорежима при центрифугировании,П р и м е р 1. Вьщеление плазмидыр 11 Г 4 К иэ ЕвсЬег 1 сМа со 11 НВ 101,Культуру бактериальных клеток вьгращивают на двух флаконах с 75 млскошенного агара Хоттингера, рН 7,2,ов течение суток при 37 С, Клеткисмывают с агара 3 мл физиологического раствора.В Зб-миллилитровую полиалломернуюцентрифужную пробирку вносят 25 мпраствора: хлористый цезий 25 г, бромистый этидий 2 мл (из основного раствора 5 мг/мп), ТЕБ-буАер 15 мл (состав ТЕБ-буАера: трис(гидроксиметиламинометан) 5 мМ,динатриевая сольэтилендиаминтетрауксусной кислотыЭДТА 0,5 мМ, ИаС 1 5 мМ, рН 8,0). Наповерхность раствора хлористого цезия наслаивают 3 мл лиэирующей смеси: бридж1 Е дезоксихолат натрия0,57, додецилсульат натрия 0,17,ЭДТА 10 мМ, лизоцим 5 мг/мл, бромистый этидий 0,5 мг/мл, трис 50 Ы 1,рН 8,0. Уравновешивают пробирки, затем наслаивают 3 мл взвеси культурыв Аизиологическом растворе и еще2 мл лизируюшей смеси. Помещают пробирки в ротор, выдерживают 3 ч прикомнатной температуре, затем центрифугируют в ультрацентрифуге при40000 об,/мин (140000 д) при 10 С втечение 40 ч.После центриАугирования пробиркиоблучают ультрафиолетовым светом ивизуально определяют наличие плазмидной суперспирализованной ДНК. Затем прокалывают стенку пробирки иглой от шприца и собирают ДНК,Собранную ДНК освобождают от бромистого этидия и переосаждают этанолом по известной методике, Преципитатрастворяют в 500 мкл ТЕБ-буфера имкл этого раствора подвергают анализу методом электрофореза в 0,77.-номагарозном геле,П р и м е р 2, Выделение плаэмидбольшой молекулярной массы.Используют штаммы ТегзЫ"а реэ 1 з,несущие плазмиды рГгга/Тох ( . 65 МВ),рсаа (47 ), Грц (38 МД),Культуру выращивают аналогичноопримеру 1, но при 28 С 2 сут. Выделение ДНК проводят в тех же условиях,что и в примере 1,В отличие от мультикопийной плазьиды рИК 4 К крупные плазмиды предстаСоставитель О. СкуратовскаяРедактор Н, Гунько Техред М.Дидык Корректор С.1 Цекмар Заказ 6041/25 Тираж 520ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 3 143912влены в клетке лишь единичным репликоном, поэтому выход ДНК из одинакового количества биомассы соответственно меньше,5П р и м е р 3. Выделение хромосомальной ДНК из ЧЬго сЬоХегае е 11 огВ 7 79,Выделение ведут аналогично примеру 1, но время лизиса составляет 101,5 ч, а центрифугирование проводятпри 20 С.Таким образом, использование изобретения дает возможность получать высокоочищенную плазмидную и хромосомную ДНК более простым и безопасным,по сравнению с известными, способом. Формула из об р ет ения201, Способ выделения бактериальнойДНК, включающий лизис клеток смесью,етергентов и лиэоцима и ультрацент 4рифугирование в градиенте плотностихлористого цезия с бромистым этидием,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью упрощения способа, улучшениякачества целевого продукта и повышениябезопасности работ с патогенными микроорганизмами, бактериальные клеткипомещают между двумя слоями лизирукгщей смеси, наслоенной на поверхностьраствора хлористого цезия, и процессвыделения ДНК проводят в один этап взакрытой центрифужной пробирке. 2. Способ по л. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что для выделения плазмидной ДНК лизис проводят в течение 3-4 ч,3. Способ по и. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что для выделения хромосомной ДНК лизис проводят в течение 1-1,5 ч, а центрифугирование - при температуре 18-22 С, ф