Способ определения триптофансодержащих соединений и метаболитов триптофанового ряда в ликворе

СООЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 139413 1)4 С 01 И 33/4 НЫЙ КОМИТЕТ СС БРЕТЕНИЙ И ОТКРЫ ОСУДАРСТ ПО ДЕЛАМ ЕТЕНИ ИСАНИ 8 ИДЕТЕЛЬСТ ВТОРСК ударстве речиш иэатулин ров А.Ю.Лабо, с. 219-22 1(71) Новосибирский гомедицинский институт(57) Изобретение относится к медицине, точнее к биофизическим исследованиям ликвора, предназначено для использования в научно-исследовательских лабораториях и клиниках с диагностической целью. Цель иэобретения -упрощение способа путем сокращения числа трудоемких операции. Для этоголиквор обрабатывают химическим реагентом, регистрируют флюоресценцию.Находят максимум длины волны возбуждающего света ( Л р 3 ) В водных ррах этот диапазон соответствует.Л 0 З триптофана 280 нм; Л 0 З окисленных форм триптофана (серотонина)300 нм, В качестве реагента используют перекись водорода и в течение4 мин кювету с разведением ликвораоблучают монохроматическим лучом ультрафиолета при Л= 290 нм. Определяют константы скорости снчженияинтенсивности флюоресценции во времени: константу фотоокисления К, иконстанту фотохимического окисленияК. При К, = 0 и К т 0 определяюттриптофансодержащие белки, при К 0К 7 0 - метаболиты триптофановогоИзобретение относится к медицине,в частности к методам биофизическихссЛедований ликвора, и может бытьспользовано в научно-исследовательских лабораториях и клинике с диагно 5стической целью.Цель изобретения - упрощение способа за счет сокращения числа трудоемких операций.10Способ осуществляют следующим образом.При комнатной температуре в кваревую кювету Флюоресцентного спектроотометра (модель МРРН 1 ТАСН 1, Япония) наливают 1,5 мл дистиллированнойводы, добавляют 0,5 мп исследуемойжидкости. Находят максимум длины вол -1 ны возбужцающего,света ( Л ,). Дляликвора человека Л , = 280-300 нм.В водных растворах этот диапазон соответствует ,триптофана 280 нм,окисленных форм триптофана (се ротонин) 300 нм.При фиксированной 3записывают 25спектр флюоресценции исследуемой жидкости. Находят максимум длины волныфлюоресценции ( 1 фр,). Для ликворачеловека Ь М 0,р. = 335-341 нм, В водных растворах Э ф триптофана 30350 нм, Ъ ф окисленных формтриптофана (5-окситриптофансеротонин) 335 нм,Фиксируют положение монохроматорадетектора Флюоресценции в соответствии с найденной Вфд35В течение выбранного отрезка времени (4 мин) исследуемая проба облучается монохроматическим лучом ультрафиолета (УФ) -и одновременно непрерывно записывается динамика квантового выхода (интенсивность) флюоресценции на длине ;волны А ф,р -режим Фотоокисления флюоресцирующегосубстрата (К 1) .В кювету к исследуемой жидкостидобавляют перекись водорода (25 мкл)и также в течение 4 мин облучают монохроматическим УФ при Ъцц = 300 нм.Исследуют жидкость с добавленнойк ней перекисью водорода - режим фотохимического окисления флюоресцирующего субстрата (К 2),По начальным и конечным значениямточек кривых находят значения констант скоростей: фотоокисления Фпюод 1.ресцирующего субстрата К, = -- ; фотохимического окисления Флюоресцируд 1,ющего субстрата К= -- где д 1 -Эразница интенсивностей флюоресценцин.При К = О, К г 0 источником флюоресценции является триптофан, а приК 7 О, Кд 1 0 источником флюоресценцииявляются окисленные формы триптофана.Продолжительность исследования10-12 мин,П р и м е р 1. Больной Шурыгин,б 2 года. Люмбальная пункция. Ликворпрозрачный. Диагноз - склероз сосудов головного мозга.При комнатной температуре в кварцевую кювету Флюоресцентного спектроФотометра наливают 1,5 мл дистиллированной воды и добавляют 0,5 мл исследуемого ликвора.Находят максимум длины волны возбуждающего света В= 290 нм.Фиксируют В Вщ = 290 нм и записываютспектр фпюоресценции разведения ликвора больного.Находят максимум длины волны флуоресценции,р = 335 нм. Фиксируютположение монохроматора детекторафлюоресценции ( Ъ , р = 335 нм). Втечение 4 мин облучают разведениеликвора монохроматическим лучом УФ(290 нм) и одновременно записываютдинамикуквантового выхода интенсивности флюоресценции на длине волны335 нм - режим фотоокисления разведения ликвора,В кювету с разведением ликвврадобавляют перекись водорода в объеме25 мкл и также в течение 4 мин облучают монохроматическим ультрафиолетом при 3 , = 290 нм.По начальным и конечным значениями точек кривых определяют значениеконстант скоростей: фотоокислениед 1К = - ; д 1 = 0; К = 0 и фотохимид 1 ческое окисление К= в , д 1 7 О;К О.Заключение: в ликворе больногоприсутствует триптофан,П р и м е р 2, Больной Семенов,23 года. Люмбальная пункция. Ликворксантохромный. Диагноз - менингит.При комнатной температуре в кварцевую кювету флюоресцентного спектроФотометра наливают 1,5 мл дистиллированной воды и добавляют 0,5 мл исследуемого ликвора. Находят .максимапьную длину волны возбуждающего1394136 ведением фото- и биохимического окисления исследуемой жидкости прии 3, соответствующих фромофорам триптофанового ряда, чувствительность, позволяющая обнаружить неменее 10 ф г/мл Флюоресцирующего субстрата при использовании Флюориметрас техническими параметрами, аналогичными ИГР, минимальный используемый объем ликвора О,1 мп, продолжительность исследования 10-12 мин. Составитель Н.ГуляеваТехред И.Коргецтал Редактор Г,Волкова Корректор О.Кундрик Тираж 847 Заказ 2215/41 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 светаз = 290 нм, Фиксируют290 вм и записывают спектр Флуоресценции разведения ликвора.Находят максимум длины волны Флюо 5 ресценции 1 ф,б,р = 335 лм. Фиксируют положение монохроматора детектора флюоресценции (В , 335 нм),В течение 4 мин исследуемая проба ликвора облучается монохроматическим 10 лучом ультрафиолета (в, = 290 нм) и одновременно непрерывно записывается динамика квантового выхода (интенсивность) Флюоресценции на длине волны 3, = 335 нм - режим фото В окисления Флюоресцирующего субстрата (К,).В кювету с исследуемым разведением ликвора добавляют перекись водорода (25 мкл) и также в течение 4 мин 20 облучают исследуемую жидкость с добавленной к ней перекисью водорода при 3 з 6 = 290 нм - режим фотохимического окисления разведения ликвоРа (К) . 25При К,0 и К з 0 в ликворе присутствуют окисленные формы триптофана.Преимуществами предлагаемого способа являются простота, специфичность чп способа, которая обеспечивается проформула изобретенияСпособ определения триптофансодержащих соединений и метаболитов триптофанового ряда в ликворе путем обработки ликвора химическим агентом с последующей регистрацией флюоресценции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа трудоемких операций, в качестве реагента используют перекись водорода, определяют константы скорости снижения интенсивности флюоресценции во времени: константу Фотоокисления К и константу фото 1химического окисления К, причем при К= 0 и К) 0 определяют триптофансодержащие белки, а при К 17 О, К 70.ф. метаболиты триптофанового ряда.