Способ стабилизации синаптосом

СООЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ ЯО 83204 РЕСПУБЛИК Я 33/4 4 Фрц/ ИЯ " снхиатри психи цессов оввп з Автореф. 983, с.2 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт клиническойВсесоюзного научного центрческого здоровья АМН СССР(56) Прилипко Л,Л. Роль прперекисного окисления липидреждении мембранных структупри стрессе и гипероксии.дис. д-ра биол, наук. М.,(54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ СИНАПТОСОМ(57) Изобретение относится к физикохимической биологии, касается способа устранения повреждения биологических мембран, вызванных действием фосфолипаз, и предназначен для оптимизации длительного хранения препаратовбиологических мембран. Цель изобретения - упрощение способа за счетсокращения числа операций при одновременном сокращении времени инкубации, Для этого к суспензии синаптосом добавляют спиртовой р-р альфатокоферола из расчета 10 мольмгсинаптосомального белка и инкубируют3-5 мин, Объем добавленного этанолане должен превьппать 17 1 табл.тохондрий, которые соответствуют плот ности 0,3 М сахарозы, Слой 0,8 М сахарозы, содержащий синаптосомы, отделяют и центрифугируют при 10000 я в течение 10 мин, а затем ресуспендируют в среде Кребса-Рингера, К 1,мл полученных таким образом синаптосом, обработанных фосфолипазой А,(300 мкг белка, степень обработки соответствует 7-25%), добавляют 3 10 моль альвфа-токоферола в 10 мкл этанола и ин кубируют 4 мин.Важнейшей структурно-функциональной характеристикой мембран синаптосом является их трансмембранный потенциал. Обработка синаптосом Фосфо липазами А , С или Э приводит к изменению величины трансмембранного потенциала, оцениваемой по изменению флуоресценции потенциал-чувствительного флуоресцентного зонда 3,3-дипропил,2-тиокарбоцианида И-Б-С-(5). Действие фосфолипаз А , С или П приводит к увеличению интенсивности потенциал-зависимой флуоресценции д- Я-С -(5)у что соответствует снижению величины трансмембранного потенциала. При 7-10% гидролиза фосфолипидов фосфолипазами А, С или Р наблюдается максимальная деполяризация синаптоИзобретение относится к области биологии, в частности к Физико-хими ческой биологии, касается способа устранения повреждения биологических мембран, вызванных действием фосфолипаз, и может быть использовано дляоптимизации длительного хранения препаратов биологических мембран.Цель изобретения - упрощение спо,соба за счет сокращения числа операций при одновременном сокращении вре,мени инкубации.Способ осуществляют следующим образом,К суспензии синаптосом добавляют спиртовой раствор альфа-токоферола из расчета 10моль/мг синаптосомального белка и инкубируют 3-5 мин,Объем добавленного этанола не долженпревышать 1%.П р и м е р. Серое вещество мозгакрыс Вистар гомогенизируют в средеКребса-Рингера, затем центрифугируют10 мин при 3000 д для удаления ядери неразрушенных клеток, Полученныйсупернатант центрифугируют в градиенте плотности (0,3 и 0,8 М) сахарозы при 10000 я 20 мин для отделения ми 10152025 сом. Через 3-5 мин после введенияальфа-токоферола в количестве10 моль/мг синаптосомального белканаблюдается снижение величины потенциал-зависимой флуоресценции й-Сз(5) до исходного уровня, т.е. полноевосстановление величины трансмембранного потенциала, сниженной в результате действия фосфолипаз, что свидетельствует об устранении их повреждающего действия,Другой важной характеристикой синаптических мембран, определяющейподвижность мембранных рецепторов ирегулирующей активность интегральныхферментов, является микровязкостьлипидного бислоя,В таблице указано изменение времени вращательной корреляции нитроксилсодержащего эфира стеариновой кислоты , встроенного в мембраны синаптосом мозга крыс, при действии Фос-фолипаз и Ы-токоферола при 37 С.Из данных, представленных в таблице, видно, что обработка фосфолипазами А и С, соответствующая 20-25%гидролиза Фосфолипидов, ведет к снижению микровязкости липидного бислоясинаптосом, оцениваемой по временивращательной корреляцииспиновогозонда - нитроксил-содержащего эфира,стеариновой кислоты. Аналогичная поинтенсивности обработка фосфолипазовП не приводит к изменению микровязкости липидного бислоя синаптосомальных мембран.При 37 С уменьшение микровязкостйлипидного бислоя мембран синаптосомвыражается в снижении времени вращательной корреляции зонда с 2,5 10до 2,0 .10 с, Введение альфа-токоферола в количестве 10 моль/мг синап, тосомального белка к синаптосомам,обработанным, Фосфолипазами, приводит к увеличению микровязкости липидного бислоя. Это выражается в увеличении времени вращательной корреляции спинового зонда до 1 1, О,10 9 с. Таким образом, введением альфа-токоферола достигается увеличение микровязкости липидного бислоя мембран синаптосом, которая была снижена в результате действия фосфолипаз, что свидетельствует об устранении их повреждающего действия.Предлагаемый способ обеспечивает быстрое и эффективное устранение повреждающего действия фосфолипаз раз1383204 Время вращательнойкорреляциизондас Воздействие 2,5 10 Интактные синаптосомыСинаптосомы, обработанные фосфолипазой А2,010 Синаптосомы, обработанные фосфолипазой С 2,010 Формула изобретения Синаптосомы, обработанные фосфолипазой Э 2;0 10Заказ 1288/40 Тираж 847 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 личного типа на синаптосомы мозга.Преимущества предлагаемого способа -простота, высокие скорость и эффективность, широкий спектр действия.Тот факт, что предлагаемый способобеспечивает восстановление такихпараметров, измененных при действиифосфолипаз, как микровязкость итрансмембранный потенциал, которыеопределяют структурно-функциональноесостояние различных биологическихмембран, означает, что он может бытьиспользован для стабилизации различных мембранных препаратов от повреждающего действия фосфолипаз В частности, данный метод может быть использован при длительном хранениипрепаратов биомембран, когда они повреждаются в результате действия эндогенных фосфолипаз. Способ стабилизации синаптосом пу тем добавления в суспенэию синаптосом агента, связывающего продукты гидро- лиза фосфолипидов с последующей инкубацией, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа операций при одновременном сокращении времени инкубации, в .качестве агента используют альфа-токоферол в этанольном раствотре, взятый в соотношении 10 моль/мг синаптосомального белка, причем конечный объем этанола не превышает 17., а время инкубации составляет 4+1 мин.