Способ определения активности гиалуронидазы

(50 4 С 01 И 33/48 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРГ 10 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Московский ордена ТрудовогоКрасного Знамени стоматологическийинститут им, Н,А. Семашко(57) Изобретение относится к биохимии, а именно к способу определенияактивности гиалуронидазы. Цель изобретения - упрощение способа за счетиспользования в качестве субстратастекловидного тела глаза. Фрагментыстекловидного тела смешивают с растворЬм гйалуронидазы. Активность препарата гиалуронидазы изменяют путемчастичной замены растворов ферментараствором сывороточного альбумина.В одни контрольные пробы с интактным стекловидным телом вводят по0,01 мл дистиллированной воды, в другие - раствор гиалуронидазы с активностью 2,5 ед./мг, но предварительноинактивированной нагреванием, Всепробы инкубируют при рН от 7,0-8,3в течение 45-75 мин. Пробы стекловидного тела переносят в чашки Петри.Отмечают момент нанесения проб и мо"мент их полного высыхания, Активностьгиалуронидазы выражают в относительных единицах, которые получают путем соотношения времени высыханияконтрольной пробы с дистиллированной водой ко времени высыхания пробыс ферментом. 3 табл,Таблица 1щ В1Количествогиалурови"даэы Вваденной впробустекловидного тела,мг Количество альбу- мина, введенного в пробу стекловидного тела, мг Отношение вре" меви высыхания Время высыхания ввВремя вцсыхаввя пробстекловидного тела с предварительно прогретой гвалуровидаэоймии Фактическая гна- луронндаэвая активность впробе, ед,lмг емя яысыиия проб вкловидвого ела с гиалу" видазой и. ьбумивом;мвв интактвогостекловидноготела ко .временн высыханиястекловидноготела с гвчлуровидаэой иальбумивоиотносительные тактиого стекловидного тела,мив едю 1136+001 117 йО,О 1,095 ф О, 01 1, 081+ 0,01 1068 ЙО 01 1 ОЗЕРО 0 1025100 1002001 1466143 1492155 166 бф 48 166,5 5,0 682 МО 1629153 70 3 ф 5 8 169,5 а 4,0 1548 ф 50,10 1,5 1702152 10 167 116 1 16865, 1 165014 1 16611 42 154,45,7 157,8+5,2 160,М 5,91620+5 1 0,15 162915 2 163,524,0 1651 32 165,9+4,2 0,7 О 05О 20 0,03 0,22 0,3 1672 ЙЭ 4 1669+35 0,25 О 9 12Изобретение относится к медицнне-;.биохимии и медицинской технике, аименно к определению активности гиалуронидазы, препарат которой применяется в клинике, биохимических и медицинских исследованиях.Цель изобретения - упрощение способа за счет использования в качестве субстрата стекловидного телаглаза,Способ осуществляют следующимобразом,П р и м е р. Фрагменты стекловидного тела доводят до рН 7,4, затемпо 0,05 мл стекловидного тела набирают в стеклянные градуированные трубочки, Для каждого измерения берутпо три параллельные пробы. В отмеренные объемы стекловидного тела спомощью микрошприца вводят по0,01 мл раствора гиалуронидазы (активностью 10 ед./мг). В опытах активность препарата гиалуронидазыискусственно изменяют путем частичной замены растворов фермента раствором сывороточного альбумина. В одниконтрольные пробы с интактным стекло 36371 2видным телом вводят по 0,01 мл дистиллированной воды. В другие - раствор гиалуронидазы с активностью2,5 ед./мг но предварительно инако 5 тивированной нагреванием (при бО С15 мин). Все пробы инкубируют в термостате при 37 С бО мин. Далее пробыстекловидного тела переносят в отдельные чашки Петри и распределяютна дне в пределах окружностей с диаметром 15 мм, Чтобы избежать движенийвоздуха и неравномерной скорости испарения воды из проб, чашки наполовину прикрывают крышками. Момент 15 нанесения проб и момент их полноговысыхания регистрируют, Высушиваниеопроб проводят при 20-22 С, Активностьгиалуронидаэы выражают в относительных единицах, которые получают путем 20 отношения времени высыхания контрольной пробы с дистиллированной водойко времени высыхания пробы с ферментом,В табл 1 приведено определениеактивности гиалуронидазы предлагаемым способом при рН 7,4 и инкубацииреакционной смеси бО мин.236371 4щим активность 1,5 ед, получена ееотносительная активность, равная1,095, Для получения фактическогоэначения активности, которое равно1,5 ед., необходимо величину 1,095умножить на величину 1,369. Эта величина получена из отношения 1,5 к1,095. Поскольку между сравниваемымивеличинами имеется определенная эа висимость, то для удобства переведения относительных единиц активностиисследуемых препаратов гиалуронидаэыв иэвестные единицы можно составитьсоответствующую номограмму.Приготовление субстрата прШмым способом эаключается во в Активность гиалуронидаэы при предельных значениях рН (Фактическая активность 1,0 ед,/мг) и времени инкубации (фактическая активность 10 ед./мг) приведена в табл, 2 и 3. 5 Т а блица 2 рН 5 082 ф 0 7 кй его ения ным. тки ге- тво 1,079+0,0 3 абли В Отношение времени высыханинтактного стекловидноготела ко времени высыхания Формул з о е стекловидного тела с г ронидаэой 5110,01 7,119 ф 0,0 40 Составитель Н, Гуляектор С. Патрушева Техред В.Кадар Луговая ек Заказ 3083 6 Тираж 778 ВНИИПИ Государственного комитета С по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб., Подписно лиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная,эводствен тношение времени высыханиянтактного стекловидного теа ко времени высыханиятекловидного тела с гиалуроидаэой Известную активность гиалуронидаэы, выраженную в ед.мг, можно сопоставить с относительными едини цами активности, полученными предлагаемым способом, путем умножения этих относительных единиц на величи ну, полученную от отношения Фактич кой величины активности к относител ной величине активности. Например, после обработки пробы стекловидног тела раствором гиалуронидаэы, имеюлаза животного или трупа челоэвлечение сткеловидного тела отмеривании. Процедура пригото субстрата по сравнению с извес способом исключает операции очифрагментации, стерилизации, гомниэации пупочных канатиков и рарения гиалуроновой кислоты,Способ определения активности гиалуронидазы путем смешивания субстрата с ферментом, инкубации реакционной смеси и определения степени гидролиза субстрата, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве субстрата используют стекловидное тело глаза, инкубацию проводят при рН 7,0-8,3 в течение 45-75 мин, а степень гидро- лиза Субстрата определяют по соотношению скоростей высыхания реакционной смеси и нативного препарата стек ловидного тела, причем большее соотношение соответствует более. высокой активности фермента.