Способ криоконсервации апексов растений

(54) (57) СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ АПЕКСОВ РАСТЕНИИ, включающий их предварительную подготовку, размещение, в ампуле с поперечной перегородкой. медленное программное замораживание в присутствии криопротектора с использованием затравки кристаллизации раствора криопротектора и последующей стабилизацией температуры до момента образования кристаллов льда во всем объеме раствора криопротектора в процессе замораживания и хранение апексов в жидком азоте, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности и способности к регенерации апексов, увеличения надежности и упрощения способа, заполняют разделенные перегородкой верхнюю и нижнюю части ампулы раствором криопротектора раздельно с помощью вставленной в отверстие перегородки трубки с образованием воздушной прослойки между ними, а затравку производят путем кратковременного пропускания жидкого азота через нижние концы ампул.(71) Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева(56) 1. Тож 111 1 Е. Ьо 1 апшп 1 цЬегозцгп: а пюйе 1 1 ог в 1 цду 1 пд 1 Ье сгуоЬ 1 о 1 оду о 1 зЬоо 1- брв 1 п Ве 1 цЬег-Ьеаг 1 пд Ьоапщп зрес 1 ез.- Р 1 ап 1 зс 1 епсе 1 еНегз. Ч.20, п 4, р. 315, 1981.2. Ьа 1 са 1 А. Уапта 1 саюа М., За 1 са 1 а Р Нагада Т., уа 1 цжа Т. Речеорвеп 1 о 1 а жЬо 1 е р 1 ап 1 1 гогп ап ехс 1 зей з 1 гачЬеггу гцппег арех 1 гогеп 1 о - 196 С. - 1.оъ 1 егпрега 1 цге зс 1 епсе, Я В, 36,п. 1, р. 31, 1978.3. Манжулин А. В., Попов А. С., Бутенко Р. Г. Способ сохранения генофонда сортов и видов картофеля. 17.02.83 (прототип). ДУ 1138097 АИзобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам низкотемпературного хранения тканей и клеток растений, и может быть использовано для длительного сохранения образцов диких и культурных видов растений.В настоящее время проблема сохране-ния всего разнообразия растительного мира является одной из первостепенных. Полное исчезновение представителей редких видов растений, а также возможность безвозмезд ной утраты ценных форм из числа наиболее распространенных видов говорит о необходимости безотлагательного решения этой проблемы. В связи с этим исследователи ряда стран занимаются разработкой новых и усовершенствованием уже существующих способов хранения видов растений. Большие, надежды возлагают на создание банка генов путем сохранения апексов (точек роста) растений при сверхнизких температурах. 20Известны способы сохранения генофонда растений, основанные на глубоком замораживании апексов 1 и 2.Однако данные способы или рассчитаны на ступенчатое замораживание ампул с апексами, или в случае программного замораживания для проведения затравки раствора криопротектора исследователи вынуждены нарушать режим замораживания, что может повлечь за собой гибель апексов в результате резкого перепада температур в камере программного замораживателя. Кроме того, для затравки раствора криопротектора путем внесения кристалликов льда в ампулу с помощью микро- пипетки требуются стерильные условия, что значительно осложняет процесс замораживания.Известен также способ криоконсервации апексов растений, заключающийся в медленном замораживании апексов в ампулах с проницаемой поперечной перегородкой. 40После 24 ч инкубации в присутствии 5/, диметилсульфоксида (ДМСО) апексы переносят в верхнюю часть ампулы с поперечной перегородкой, плотно прилегающей к стенкам ампулы,и разделяющей весь объем раствора ДМСО на две равные части, сообщающиеся между собой через два отверстия диаметром 0,2 мм в поперечной перегородке.Апексы охлаждают в программном замораживателе со скоростью 0,5 С/мин. При -5 С производят затравку сразу всех ампул, находящихся в специальном штативе, путем погружения их дна в жидкий азот на 0,1 сек. После этого температуру в камере замораживателя поддерживают на уровне -5 С в течение 20 мин, а затем продолжают ох лаждение апексов с первоначальной скоростью до -40 С, после чего сразу же погружают в жидкий азот (-196 С). Этот способ позволяет сохранить жизнеспособность апексов на уровне 84% после цикла замораживания - оттаивания 3.Однако заполнение ампул с поперечной перегородкой раствором криопротектора является трудоемким процессом, так как сначала необходимо заполнить раствором весь объем ампулы под перегородкой через отверстие диаметром 0,2 мм, что требует определенного опыта и сноровки, а затем с помощью пипетки заполняют раствором 2/3 объема ампулы над перегородкой и только после этого помещают замораживаемый объект в верхнюю часть ампулы,Поперечная перегородка предотвращает только непосредственный контакт апексов с быстродействующими кристаллами льда в момент затравки, но не снижает в должной мере скорость роста кристаллов льда, которые после проведения затравки свободно и быстро проникают в верхнюю часть ампулы через два отверстия диаметром 0,2 мм, без которых нельзя обойтись ввиду того, что через одно отверстие вводят раствор криопротектора шприцем в нижнюю часть ампулы, а через другое выходит замешаемый на раствор воздух.В результате того, что кристаллы льда после затравки быстро проникают через поперечную перегородку, то затравку кристаллизации можно проводить только в течение 1,0-1,3 сек, а при более продолжитель ном времени затравки увеличивается опасность повреждения замораживаемого объекта,Для проведения затравки раствора криопротектора в,процессе охлаждения открывают камеру программного замораживателя, извлекают из нее кассету с ампулами и вручную, путем кратковременного погружения дна сразу всех ампул в жидкий азот, производят затравку, после чего помещают обратно в камеру, закрывают ее и продолжают охлаждение в заданном режиме. Таким образом, процесс замораживания прерывается на самом ответственном моменте, когда нежелательное снижение или повышение температуры вследствие нарушения режима замораживания может повлечь за собой гибель меристематических верхушек.Незначительный перекос штатива с ампулами в момент проведения затравки может стать причиной гибели апексов из-за того, что при этом часть ампул не будет иметь контакта с хладагентом раствора криопротектора и в ходе дальнейшего охлаждения апексы погибнут от внутриклеточного льда, образующегося в результате переохлаждения воды в клетках апексов.Целью изобретения является повышение жизнеспособности и способности к регенерации апексов растений, увеличение надежности и упрощение способа криоконсервации.1138097 Составитель И. МарченкоТехред И, Верес Корректор В. БутягаТираж 743 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и о крытий113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Редактор Л. ГратнллоЗаказ 10577/2 Поставленная цель достигается тем, что согласно способу криоконсервации апексов растений, включающему их предварительную подготовку, размещение в ампуле с поперечной перегородкой, медленное программное замораживание в присутствии криопротектора с использованием затравки кристаллизации раствора криопротектора и последующей стабилизацией температуры до момента образования кристаллов льда во всем объеме раствора криопротектора в процессе замораживания и хранение апексов в. жидком азоте, заполняют разделенные перегородкой верхнюю и нижнюю части ампулы раствором криопротектора раздельно с помощью вставленной э отверстие перегородки трубки с образованием воздушной прослойки между ними, а затравку производят путем кратковременного пропускания жидкого азота через нижние концы ампул. В этом случае общий режим замораживания останется неизменным, а кристаллы льда, образующиеся в момент затравки, проникают в верхнюю часть ампулы только по трубке. Это исключает повреждение пексов при проведении такого рода затравк,Лример. Для замораживания используют апексы культурного тетраплоидного вида картофеля Ьоапцтп 1 цЬегозшп 1. (сорт Мая). Предварительная подготовка апексов заключается в культивировании их на жидкой питательной, среде с 5%-ным ДМСО в течение 24 ч. Размер апексов 250-500 мкм. Условия прекультивирования - температура 26 С, освещенность 5000 лк, постоянный свет, относительная влажность 70%. После предварительной подготовки апексы переносят в верхнюю часть ампулы с поперечной перегородкой, которая предварительно заполнена раствором криопротектора (0,5 мл охлажденного раствора 5/о ДМСО в среде), а затем с помощью плотно входящей в ампулу пробки перекачивают часть раствора криопротектора в нижнюю часть ампулы по трубке, расположенной по продольной оси ампулы и одним концом почти касающейся внутреннего дна нижнего ее отсека, а другим - незначительно выступающей над поперечной перегородкой в верхнем отсеке ампулы. Это обеспечивает образование воздушной прослойки над перегородкой в нижнем отсеке ампулы.После этого ампулы запечатывают и помещают в отверстия в проточной камере, которая находится внутри камеры заморажи О вателя и полностью изолирована от нее,но сообщается с внешним пространством.Замораживание проводят со скоростью 0,5 С/мин. Когда температура в камере замораживателя достигает - 5 С, проводят затравку дна сразу всех ампул путем подачи порции жидкого азота в проточную камеру. Эта процедура занимает 2,5-3,0 сек.После затравки температуру в камере замораживателя поддерживают - неизменной в течение 20 мин, а затем продолжают охлаждение апексов с первоначальной скоростью до -40 С, после чего их быстро переносят в жидкий азот (-196 С). После хранения апексов в хладагенте их извлекают из него и размораживают на водяной бане при 40 С, а затем без отмывки от кри о 11 ротектора высаживают на агаризованную среду. Условия рекультивирования такие же, как и при проведении прекультивирования, Жизнеспособность апексов после оттаивания определяют путем подсчета количества развивающихся апексов через 30 7-10 дней рекультивирования.Предлагаемый способ криоконсервацииапексов позволяет увеличить средний уровень жизнеспособности меристематических верхушек на 11,0 о/о, а способность к регенерации целого растения - на 49,0% по 35 сравнению с известным способом. Крометого, является более надежным за счет обеспечения целенаправленного (по трубке) роста кристаллов льда после затравки и менее трудоемким, так как упрощает процесс подготовки и проведения замораживания за счет исключения из него ряда операций, связанных с проведением затравки путем кратковременного погружения ампул в жидкий азот на 1,0 сек.