Способ определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек

, 105 зсю .А 6 О, А 61 К 3933 СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И СТНРЬФИ(21) 275713 М 28-13 против исследуемых иммуноглобулинов, из- (22),24,04.73 мерение зон преципитации по осуществле- (46) 30,10,83, Вол,40 нию реакции иммунодиффузии и определе-, (72) 1 О. И. Лященко ние концентрации данного вещества в ис- (53) 536,8,077(088.81 следуемом материале по графикам, выра- (56) 1, Мапс 1 п 1 б. СагЬопага А., Негевапз 1, жающим зависимость диаметра зоны пре 1 апапосйеппса 1 оцап 1 йа 11 оп о 1 анбдеп Ьу . ципитации от концентрации эталонов имупфе гайа 1 иппшбИ 1 нз 1 оп. - 1 пппцпосЬе: муноглобулинов, отличающийся тем, что, вагу, 1365, чо 1, 2,1, р, 235 - 254. с целью повышения точности локальногоопределения концентрации иммуноглобули- (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОН-. нов в секрете слизистых оболочек, исполь- ЦЕНТРАЦИИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ зуют нативный материал, забираемый с В СЕКРЕТЕ .СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК, помощью стандартных дисков из фильтровключающий размещение исследуемого ма-., вальной бумаги. а для сравнения испольгериала н материала с эталонной концент зуют аналогичные диски, пропитанные этарацией иммуноглобулинов на поверхноств лонными концентрациями данного вида гелеобразной среды, содержащей антитела антител,Изобретение относится к медицине, аименно к иммунологии, и касается методикиисследования секреторных антител (имму-,ноглобулинов), которые играют важнуюроль в защите организма от инфекции. Иммуиоглобулины синтезируются лимфоидными клетками, расположеннымн в толщеслизистых оболочек, и выделяются вместесо слизью на ее поверхнось.Известен способ определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слиэис, 10тых оболочек, использующий реакцию радиальной нммунодиффузии (РИД) в агаре по Мапс 1 п 1 (1965), которая основана наспособности иммуноглобулинов биологических жидкостей образовывать преципитатпри соединении с антителамн против данного вида иммуноглобулинов 1).При таком способе в 1,5-35,-ный агар,приготовленный на 0,1 М мединал-верона-,ловом буфере (рН 8,6), вносятся антитела:против исследуемого вида иммуноглооулинов. В сделанные в агаре с антителами против 1 лунки вносятся эталоны различной:концентрации данного вида иммуноглобули-,нов. В такие же лунки вносится исследуемый материал. В результате взаимодействия иммуиоглобулинов, содержащихсяв исследуемом материале, и антител, на-:ходящихся в агаре, вокруг лунок образуются округлой формы зоны прецнпитации.Их диаметр. находится в линейной зависимости от концентрации иммуноглобулинов, З 0чаходящнхся в лунках, По графикам, выражающим зависимость диаметра зоныпреципитации от концентрации эталоновиммуноглобулиновопределяют концентрацию данного вещества в исследуемом материале. Однако такой .способ неприемлем для .35определения концентрации иммуноглобулинов в секретах верхних дыхательных путей,миндалин, кишечника и т.д., которые забирать в нативном состоянии невозможноиз-за незначительного их количества (они 40покрывают слизистую оболочку в виде тонкого слоя влаги). В связи с указанным обстоятельством секрет слизистой оболочкизабирают путем промывания оболочки буферными растворами хлорида натрия и исследуют иммуноглобулнны в смывах. Резуль-, 45татытакого исследования не дают достаточной точности, так как объемсмываемогоматериала может колебаться в большихдиапазонах.,Цель изобретения - повышение точности локальногоопределения концентрации 50иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек,Указанная цель достигается тем, чтосогласно способу определения концентрации иммуноглобулинов в секрете слизистых оболочек, включающему размещение исследуемого материала и материала с эта лонной концентрацией иммуиоглобулинов на поверхности гелеобразиой среды, содер жащей антитела против исследуемых имму ноглобулннов, измерение эон преципитации по осуществлению реакции иммунодиффузиин определение концентрации данного вещест ва в исследуемом материале по графикам, выражающим зависимость диаметра зоныприципитации от концентрации эталонов иммуноглобулинов, используют нативныйматериал, эабираемый с помощью стан-, дартных дисков из фильтровальной бумаги, а для сравнения используют аналогичные диски, пропитанные эталонными кои.центрациями данного вида антител.Способ осуществляют следующим образом. ФДля забора материала (секрета слизистых оболочек) применяют стандартные диски из фильтровальной бумаги ГОСТ - 12026-66, диаметром 7 мм, Материал из слизистых оболочек забирают путем приклады-;вания дисков к поверхности слизистых оболочек до тех пор, пока они не пропитаютсясекретом (до появления на поверхностидиска избытка жидкости). Избыток секретаснимают с диска путем проникновения ихк листу мелованной бумаги,Поскольку диски являются стандартными, каждый из них способен впитать практически один и тот же объем секрета. Про-питанные исследуемым материалом дискивысушивают и хранят до момента проведения исследований в безводной атмосфере,в эксикаторе с. помощью влагопоглотителя (пятиокись фосфора и др.).В таком состоянии они сохраняютсябез потери содержания иммуноглобулиновв течение 3 мес.Исследование концентрации иммуноглобулинов в лисках, пропитанных секретомслизистой оболочки, осуществляют в реакции радиальной иммунодиффуэии в агаре.Для этого используют 1,5%-ый агар Дифко,приготовленный,на 0,05 М мединал-вероналовом буфере (рН 8,6). Антисывороткупротив соответствующих видов иммуноглобулинов вносят в расплавленный агар притемпературе среды, равной 56 С. Количество сыворотки , которое необходимо внестив агар, определяют опытным путем.Обычно ее применяют в два раза меньшем количестве, чем при исследовании сывороточных иммуноглобулинов. Смесь агара и антисыворотки выливают в емкость,образованную двумя стеклянными пласти.нами размером 9 х 12 см и П-образной рамкой, располагаемой между ними (толщинарамки 1 мм). После остываняя агара однуиз пластин снимают путем скольжения поповерхности застывшей среды., На освобо-,дившуюся поверхность агара с антисыворот-,кой против определенного вида иммуногло-булинов в соответствии с заранее иэготовлеи 1ным трафаретом раскладывают диски, про 43питанные исследуемым секретом, а такжедиски, проп 1 ита нные эталонными концентрациями исследуемых веществ. Стеклянные пластины со смесью агара и антисыворотки и помещенными иа них дисками ставят во влажную камеру при 1= 18-20 С. Оптимальный срок инкубации составляет. 5 сут, После этого пластины выдерживают 6 ч в изотоническом растворе хлорида натрия, красят в течение 2 ч в 1%- ном растворе амида черного, приготовленного на 3%-иом.10 растворе уксусной кислоты, отмывают в 3%-ном растворе уксусной кислоты и изме ряют диаметр зон преципитации вокруг:, каждого из дисков.На масштабной бумаге строят графики выражающиезависимость диаметра зоипрецнпитации . от концентрации данного нида антител в диске, По этим графикам определяют концентрацию иммуноглобу-, линов в исследуемом материале.20Как показали сравнительные исследова-: ния концентрации иммуноглобулинов секре та небных миндалин у здоровых людей и лиц, часто страдающих ангиной, секреторные иммуноглобулины миндалин представ.лены ие только 1 вА, как это характернодля большинства слизистых оболочек, нои 1 б и частично 1 Ме, прн этом была;определена их фактическая концентрация в данном биологическом субстрате. Концентрация иммуноглобулинов у здоровых людейбыла следующая1 в А= 0,73 + 0,06 10, а 16 = 1,8640,8 10мгй,У людей, часто болеющих ангиной, концентрация 1 о А соответствовала 0,33 0,02 10а 1 б - 0,83+,0,06 10 .г/л.Предлагаемый способ исследования может быть использован для определения концентрации иммуноглобулинов в секретах,которые получать в натнвном состоянииизвестным способом не представляется воз.можным,Таким образом, предлагаемый способпозволяет повысить точность исследованийпри локальных определениях коннентраций различных иммуноглобулннов и тем самым повысить их диагностическую ценность.Редактор П. Макаревич Заказ 8521/5 Составитель И. Горелова Техред И. Верес Корректор М. Демчик Тираж 713 Полянское,ВНИИПИ Государствснного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патентэ, г. Ужгород, ул. Проектная, 4