Способ определения степени деструкции клеток

Изобретение относится к криобиологии, в частности к способам определения степени деструкции клеток ткани,Известен способ определения деструкции клеток злокачественных опу"холей в организме человека, которыйсостоит в определении количества клеток в моче человека, разрушенныхэтерификацией высшими жирными кисло"тами при рН 4,2 - 58 и 80 - 85 бС (11.Однако способ применим только кзлокачественным клеткам и не позволяет непосредственно наблюдать повреждения клеток в процессе экстремальныхвоздействий,Известен также способ определения 15степени деструкции клеток ткани иклеточных суспензий, включающий полу.чение исследуемого материала и воздействие на клеточные суспензииэкстремального Фактора с последующей 2 Орегистрацией Физико-химических изменений в реакционной смеси 2),Однако способ применим только дляэритроцитов, исключает возможностьнепосредственного наблюдения повреждения, а также определяет толькогрубые нарушения мембраны клеток(диаметр молекулы гемоглобина больше 80 Д), является длительным (4060 мин).Целью изобретения является повыше"ние точности и ускорения способа.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу определения сте"пени деструкции клеток, включающемуполучение исследуемого материала и1 воздействие на клеточные суспенэииэкстремального Фактора, к клеточнымсуспенэиям добавляют 10 - 2 10 Мраствора 2,2,6,6-тетраметил-оксопиперидин-оксила и 0,5 - 2,0 М ,40раствор хлористого никеля и по величине сигнала злектропарамагнитногорезонанса определяют степень деструк-ции клеток.45Способ осуществляют следующим об"разом.В исследуемую взвесь клеток вводят водный раствор, который содержитстабильный иминоксильный радикал сконцентрацией 10-2 10 М, проникаю"щий в цитозоль клеток и дающий сиг"нал электропарамагнитного резонанса(ЭПР), регистрируемый на радиоспект"рометре. Затем добавляют парамагнитную соль концентрации 0,5 " 2 М (внорме не проникающую через мембра"ну), что приводит вследствие обменных взаимодействий к уширению (исчезновению) сигнала ЭПР от радикала;находящегося во внеклеточной жидкости, в результате чего наблюдаетсясигнал исключительно от радикалов вцитозоле, нарушение целостности мемб"раны клеток приводит к проникновениюпарамагнитных ионов в цитоэоль и к полному или частичному исчезновению сигнала ЭПР. При этом уменьшение сигнала ЭПР пропорционально количеству разрушенных клеток ткани или клеточной суспензии.В стеклянную ампулу вводят 0,1 1,0 мл водного раствора иминоксильного радикала концентрации 10 - 2 40 М, 0,1 - 1,0 мл парамагнитной со 2ли концентрацией 0,5 - 2,0 М и 0,8" 8,0 мл взвеси клеток, в результате чего наблюдают сигнал ЭПР от радикалов, проникших в нитозоль клеток. Затем исследуемую взвесь подвергают температурному, химическому, радиоактивному или другим воздействиям. Если в результате происходит повреждение мембраны клеток, регистрируемый спектр имеет меньшую или нулевую интенсивность, в зависимости от числа поврежденных клеток. Отношение Ь 0 к Ь 0 дает процент неповрежденных клеток.П р и м е р 1. В стеклянную ампулу вводят 0,1 мл водного раствора иминоксильного радикала 2,2,б,б-тетраметил-оксопиеридин"1-оксил с концентрацией 10 М 0,1 мл водного раствора парамагнитной соли И 1 С 1 д и 0,8 мл взвеси эритроцитов. Охлаждение взвеси клеток до температуры - 3 С с кристаллизацией суспензии и опоследующий отогрев ее приводит к уменьшению исходного сигнала ЭПР за счет разрушения части клеток. Относительная величина неповрежденных в . результате кристаллизации и отогрева клеток составляет 56.П р и м е р 2, В стеклянную ампу" лу вводят 0,1 мл водного раствора радикала 2,2,6,6-тетраметил-оксо- пиперидин-оксил с концентрацией 1 ФМ и кусочек ткани кожи человека весом 100 мг. Затем осуществляют инкубацию при комнатной температуре в ,течение 30 мин. После этоГо добавляют 0,1 мл раствора соли НхС 1 концентрацией 0,05 М и наблюдают сигнал от радикала в цитозоле клеток ткани кожиМедленное .замораживание об" раэца со скоростью З.град/мин; до.".1960 С и медленное оттаивание до ком" натной температуры приводит к падению интенсивности исходного сигнала на 15 Ъ, что свидетельствует о разрушении 15 клеток,1П р и м е р 3. В стеклянную ам дулу вводят 0,1 мл водного раствора иминоксильного радикала с концентрацией 10 М; 0,1 мл водного раствора-2парамагнитной соли (П.С 1 с концентрацией 0,5 М и 0,8 мл взвеси эритро" цитов. Наблкдают спектр ЭПР от радикалов в цитозоле эритроцитов. Далее медленно нагревают взвесь со скоростью 2 - 3 град/мин. Выше температуры +56,С происходит резкое исчезновение10 ИВ 08 Составитель Е.ЖитниковаТехред А.Бабинец Корректор А.Зимокосов зРедактор Н. Бобкова иавйааю ЮаВвеЮеЮеееЭЮЮФФВеЮааЮеФ ее а аеююеюавювсют ююююю Заказ 8407/41, Тираж 873 , Подпионое ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5ФИлиал ППП ефПатент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 сигнала ЭПР вследствие разрушения клеток эритроцитов.П р и м е р 4, В стеклянную ампулу вводят 0,1 мл водного раствора иминоксильного радикала с концентрацией 1 ФМ 1 0,1 мл раствора соли МХС 1 (0,5 М и 0,8 мл взвеси эритроцитов. Наблюдают сцектр ЭПР от радикалов в цитоплазме эритроцитов . Затем добавляют 0,1 мл раствора прижина так, что конечная концентрация его около 3. Взвесь инкубируют при 38 С . в течение 40 мин. Берут дроби через каждые 10 мин, Сигнал ЭПР с течением времени постепенно падает и через 40 мин его интенсивность составляет 40 от исходной, т.е. остается 40 целых клеток. Таким образом, наблю" дают кинетику разрушения эритроцитов с помошью протеолитического Фер. мента Прижива, который расцепляет пентидные связи поверхностных мемб-, ранных белков эритроцитов. П р и м е р 5. В стеклянную ампулу вводят 0,1 мл раствора цминоксильного радикала концентрацией 10 "М 1 0,1 мл раствора соли МАС 1 у(0,5 М) и 0,8 мл взвеси зритроцитов. Наблюдают спектр ЭПР от зондов в цитоплаз" ме. Затем добавляют раствор химического детергента тритона К 100 в концентрации 0,1. Время инкубации при комнатной температуре 5 мин. Регистрация спектров после этого показывает полное исчезновение сигнала ЭПР вследствие проникновения ионов НХ в клетки из-за разрушения клеток.Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволя" ет добиться высокой точности определения за счет оценки количества неповрежденных клеток во время воздей" ствия экстремальноГо Фактора, а так .же сократить время определения до 3 - 5 мин.