Способ определения пиридоксаля и пиридоксаль-5-фосфата при их совместном присутствии в растворе

СОЮЗ, СОВЕТСКИХосцМлеаксни,РЕСПУБЛИК ОЮ 01) О 1 А 3 цц С 01 К 2 64 О Н ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРт илАМ иванаОВМЙ и ОЗМНТЮ ПИСАНИЕ ИЗОБР ВТОРСКОМУ СИИД ЖИТЕЛЬСТВ(71) Институт молекулярной биологии АН СССР и Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза (53) 543,432(088.8)(56) 1. СЬаоЬап М,Б , Ра 1 сзЬдпаапгК. Ицогоаейгс Аззау оЕ Руг 1- Йоха 1 апд РугИоха 1-5 -РЬозрЬайе. Апа 1, В 1 осЬет, 96, 426-432, 1979 (прототип). 54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРИДОКАЛЯ И ПИРИДОКСАЛЬ-ФОСФАТА ПРИ . ИХ СОВМЕСТНОМ ПРИСУТСТВИИ В РАСТВОРЕс использованием обработки анализируемой пробы химическим реагентоми измерением интенсивности флуоресценции образующегося соединения,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью упрощения способа, анализируемую пробу обрабатывают раствором0-метилгидроксиламина в Ма-ацетатном буфере с рН 4-5 до концентрации0-метилгндроксиламина в пробе 1 ОЪ,раствор инкубируют, доводят рН до6-7, измеряют интенсивность флуоресценции с последующим добавлением0-метилгндроксиламина до концентрации 10 М, доведением рН до 4-5, ин-,кубированием раствора, доведениемрН до 6-7, измерением интенсивностифлуоресценции и расчетом по формуле.1 1 1 1,8Изобретение относится к биохимии , преимущественно аналитической и клинической , и мохи. т быть использовано . в энэ имологии и медицине .Пиридоксаль -фосфат ( ПЛФявляется основной коферментной формой витамина В . В биологическом материале помимо ПЛФ всегда имеются и дру- гие соединения группы витамина В, в особенности пиридоксаль ( Ш 1 . 1 О Правильная картина состояния обмена витамина В может быть получена , если определяется не только к оличе ство самого ПЛФ , но и ПЛ , а также их суммарное содержание . Существующие микробиологические и энзиматиче ские способы определения ПЛФ не позволяют проводить такой полный анализ .Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и дос тигае". мому результату является флуоресцентный метод определения ПЛФ и ПЛ , основанный на получении фотоустойчивых антранилатных производных . По этому методу анализируемую пробу обрабаты вают метилантранилатом в абсолютном метаноле , нагревают , добавляют восстановитель , снова нагревают , подкисляют раствором НС 6 в ме таноле , удаляют растворитель в вакууме , растворяют в воде , подщелачиаают , многократно извлекают водный раствор хлористым ме тиленом , Ан транилатное производное ПЛ находится в органической фа зе и его определяют после очистки на колонке с силикагелем и препаративной тонкослойной хроматографии . Для определения ПЛФ водную фазу обрабатывают щелочной фосфатаэой , после чего необходимое произ. - водное выделяют хроматографией и иэ меряют интенсивность флуоресценции растворов антранилатных производных 13.Недостатками данного метода являются многостадийность и необходи- ф 5 мость выделения, очистки и разделения производных ПЛ и ПЛФ.ф Цель изобретения - упрощение способа определения ПЛ н ПЛФ при их совместном присутствии в растворе. 50Поставленная цель достигаетсятем, что согласно предлагаемому способу анализируемую пробу обрабатваают раствором 0-метилгидроксщтамина в йа-ацетатном буфере с рН 5 4-5 до концентрации 0-метилгидроксил:амина в пробе 1 О фМ, раствор инкубируют, доводят рН до 6-7, измеряют 90 1 интенсивность флуоресценции с после. дующим добавлением 0-метилгидроксил" амина до концентрации 10М, доведением рН до 4-5, инкубированием раствора, доведением рН до 6-7, измерением интенсивности флуоресценции и расчетом по формуле. На чертеже показана кинетика убыли исходного продукта 1- о 1 в реакции 0-метилгидроксиламина с пиридоксалем и пиридоксаль-фосфатом в 0,1 М Ма-ацетатном буфере при рН 5,0 и температуре 25 С; реакция при постоянной концентрации 0-метилгидроксиламина ОМ и концентрации ПЛ и ПЛФ, равных:10М;х 10 М;Ь ВОМ.В основе предлагаемого способа лежит свойство ПЛФ образовывать О- метилоксим с большей скоростью, чем ПЛ при прочих равных условиях,На первом этапе в оксим переводится весь присутствующий в растворе ПЛФ и только часть ПЛ. Скорость преобразования ПЛФ ( концентрации4 1 О М) в соответствующий оксим . при избытке концентрации 0-метилгидроксиламина ( ОМГАв растворе (на порядок или более по сравнению с концентрацией ПЛФ ) зависит только от концентрации реагента, Это проиллюстрировано на чертеже ( кривая ПЛФ ), где показана кинетика убыли исходного продукта при концентрации ОМГА 10М и концентрациях ГЛФ в пределах 1 О - 10 М, Концентрация реагента 10 М подобрана так, чтобы примерно через 40-50 мии, когда весь ПЛФ преобразуется в соответствующий оксим, аналогичная реакция преобразования ПЛ происходила заведомоменее чем на 103.На втором этапе в оксим переводится оставшаяся в растворе часть ПЛ. Дпя этого концентрация реагента повышается до 10 М, При такой концентрации полное преобразование ПЛ в его оксим завершается примерно через 30-40 мин, Повышение концентрации в этом случае ускоряет реакцию . ОМГА с ПЛ, причем дальнейшее увеличение концентрации на порядок(1 ОМ ) дополнительно сокращает время реакции примерно в 5 раз.Способ осуществляют следующим образом.К исследуемому раствору сначала добавляют такое количество 0-метилгидроксиламина, чтобы концентрация его в исследуемом образце была порядка 10, и через определенное время производят измерение интенсивности суммарной флуоресценции (Э 1 при рН 6-7, в которую вносит вклад свечение О-метилоксима ПЛФ ( 31, а также свечение О-метилоксима ПЛ (Зг 10 образовавшегося в результате частичной трансформации ПЛ. Таким обра 5 1. 2где о - доля трансформированного ПЛ, определяемая из графика на черте"же.Затем при рН 4-5 доводят концентрацию 0-метилгидроксиламина до величины порядка 10М и спустя опре: деленное время при рН 6-7 снова производят измерение интенсивности суммарной флуоресценции ( Э ) котораягравна:1 ( )52 Э 2 25Решая совместно уравнения(11 и 2)находят величины Э и Э и, сравни" 1 вая их с. соответствующими калибровочными графиками для О-метилоксимовПЛ и. ПЛФ, определяют концентрации ПЛ и Ш 1 Ф, Этим методом определяютсяПЛ и ПЛФ в концентрациях до 10 Мвключительно при соотношении сигнал -шум 8:1.Построение калибровочных графиков.Готовят ряд растворов с заданными 35концентрациями ПЛ или ПЛФ в Ма-аце"татном буфере с рН 4-5, напримеррастворы с концентрациями, М: 1,03103,101,ОЗ10 3,10 ; 1,03-ОЗатем в каждом. растворе проводятреакцию с 0-метилгидроксиламином дляполучения соответствующих оксимов.Для этого берут 2,9 мл приготовлеМных растворов ПЛ или ПЛФ соответст" 45вующих концентраций и добавляют.0,1 мл 0,3 М раствора 0-метилгидроксиламина. При этом получающиеся врезультате разведения концентрацииоксимов соответственно равны, М:, 501(У,3.1 аф; 1 О; 3 1 Оф; О фр 3 О-а концентрация 0-метилгидроксиламина в кювете 10 М. Реакцию проводятв темноте при 25 С. Спустя 30-40 мин,доводят рН раствора до 6-7 и измеряют интенсивность флуоресценции при450 нм и длине волны возбуждающего ; света 370 нм.,Полученные данные используют для построения калибровочных графиков.Все растворы готовят на деиониэированной водеИспользуют ацетат натрия и гидроксид натрия марки "ОСЧ", уксусную и соляную кислоты, дополнительно перегоняют, хлоргидрат О-метилгидроксиламина дважды перекристаллизовыва" ют,.П р им е р 1. ГОтовят раствор, содержащий 610 "М ПЛФ и 61 О з М ПЛ. Для приготовления такого раствора делают маточные, растворы пиридоксаля и пиридоксаль-фосфата с концентрацией 10 М, из которых сначала разведением получают рабочие растворы с концентрацией веществ 10 М, а затем испытываемые.Приготовление маточного раствора пиридоксаля.Пиридоксаль гидрохлорид, МВщ 203,5, Навеску пиридоксаля 20,4 мг помещают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем до 100 мл деионизированной водой.Приготовление маточного раствора пиридоксаль-фосфата.Пиридоксаль-фосфат ( кислота),МВ 265,17. Навеску 26,5 мгпомещают в мерную колбу. емкостью 00 мл и доводят, объем до 100 мл деионизированной водой,Приготовление рабочих растворовпиридоксаля и пиридоксаль-фосфата концентрация 10 М).- 1 мл маточного раствора пиридоксаля или пиридоксаль-фосфата помещают в мерную колбу емкостью 100 мпи доводят до 100 мл 0,1 М ,Ма-ацетатным буфером с рН 5,0.Приготовление испытываемого раствора.В мерную колбу емкостью 00 мл уносят 6 мл раствора пиридоксаль- "фосфата концентрации 10 М и 0,6 млраствора пиридоксаля концентрациитакже 10"Мрабочие растворы).Объем доводят до 10 мп О, М Йаацетатным буфером с рН 5,0.Приготовление маточного раствора0-метилгидроксиламина концентрации310 фМ.О-Метилгидроксиламин, МВ 83,5.Навеску 250,5 мг помещают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем до 100 мл 0,1 М Иа-ацетатным буфером с рН 4-5,5Определение содержания пиридок 1саля и пиридоксаль-фосфата в испытываемом растворе.3 мл испытываемого раствора помещают в кювету и добавляют в него 10 мкл 302 М раствора 0"метилгидс роксиламина в 0,1 М. йа-ацетатном буфере с рН 4"5, Раствор инкубируют в темноте в течение 40-50 мин при 25 С. Затем доводят рН раствора до 6-7 и измеряют суммарную интенсивность фпуоресценции при 450 нм и длине волны возбуждающего света 370 нм,3 ,),в которую вносит вклад свечение 0-метилоксима ПЛФ -3 а также свечениеО-метилоксима ПЛ - Э 2, образовавшегося в результате частичной трансформации ПЛ, т.е.:.):.7 + оЭ5,2где о - доля трансформированного ПЛ, определяемая иэ графика кинетика убыли относительной концентрации ПЛ 0 " К) во времени, кривая ПЛ ),Через 50 мин(из графика) Ы 0,065Затем повышают концентрацию 0- метилгндроксиламина в кювете до ОМ добавлением в кювету 2,5 мг О-метилгидроксиламина, доводят рН раствора до 4-5, ннкубируют в темноте в течение 30-40 мин прн 25 С. Через 30-40 мнн доводят рН анализируемой пробй до 6-7 и измеряют суммарную интенсивность флуоресценциипри 450 нм н длине волны возбуждения 370 нм:Э :Э ЭБ2В результате получают систему из двух уравнений с двумя неизвестными:в 7,Ц,7В 1 27 :Э +71 2решая которую, находят:Э -Эг2 1-Э =Э -сПВеличины ди Э измеряют, значения е. и 1-. К находят из приве 18901 Ьденного на чертеже графика ( криваяПЛ ). По величине 7, из калибровочного графика для ПЛФ находят его концентрацию, а по величине 3 из ка 25 либровочного графика для ПЛ находятконцентрацию ПЛ.Испытываемый раствор готовят трираза. Результаты испытаний приведеныв табл.1, Значение с определяют,О по графику ( см. чертеж );Ы 0,065; 1-о =0,935. Концентрациюпиридоксаля и пиридоксаль-фосфа 1та определяют по, калибровочным графикам.5 П р и м е р 2. Готовят раствор,содержащий 6 1 О М ПЛФ и 6 1 О М ПЛ.Маточные и рабочие растворы готовятаналогично примеру 1.Приготовлениеиспытываемого рас 20 твора.В мерную колбу емкостью ОО млвносят 0,6 мл раствора пиридоксаль 15 -фосфата концентрации О 5 М и6 мл раствора пиридоксаля концентра, 25 ции 10 М (рабочие растворы). Объем доводят до 100 мл 0,1 М йа-ацетатным буфером с рН 5,0.Определение содержания пиридоксаля и ц-фосфата,в испытываемом растворе.3 мл испытываемого раствора помещают в кювету и добавляют в него10 мкл 3 1,0 М раствора 0-метилгндроксиламина в 0,1 М М а-ацетат 35ном буфере с рН 5,0, Далее повторяют все процедуры, описанные в соответствующем пункте, примера 1. Результаты испытаний приведены втабл.2,40Значения Ы определяют из графика на чертежеЫ =0,065; 1- о=0,935 ). Концентрации пиридоксаля ипиридоксаль-фосфата определяютпо калибровочным графикам,Таким образом, предлагаемый спо 45соб по сравнению с известным является более простым и быстрым и позволяет надежно определять с точностью до 1 ОХ концентрации ПЛ и ПЛФдо 1 О 5 М.501 48,0 399,6 351,7 376,1 6,05 1 О 24,4 2 47,2 382,7 336,5 359,9 5,8,ф 1023,4 3 47,5 3971 349,6 373,9 6,0 1 О 24,3 Составитель В.ШкильковаТехред О.Неце Корректор В,Бутяга Редактор М,Петрова е Тирах 822 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская иаб., д. 4/5