Способ культивирования энтомопатогенных бактерий

СОЮЗ СОВЕТСКИХРВНРРВРРРРРРЕСГМэ ЛИК й 63/00 Д,Т..1 о: ГИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ 1 А 1 Я ,У, Р, ДДО" АТ РЯБ Р ГГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЮ Н АВТОРОНОНУ ОВИВВТВРЪОТВ(71) Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии и Бердскийхимический завод(56) 1. Авторское свидетельство СССРВо заявке В 2777387/30-15,кл. С 12 К 1/00, 1979.2. Авторское свидетельство СССРпо заявке В 2921395/30-15,кл. А 01 Н 63/00, 1980.3. Авторское свидетельство СССРпо заявке В 2938125/30-15,кл. А 01 Й 63/00, 1980.(54 )(57) СПОСОБ КУЛЬТИБИРОБАНия ЭНТО- МОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ, включающий засев бактерий и их выращивание на среде, содержащей полностью гидролизованный источник углерода и полностью иличастично гндролизованньй источник азота, о т л и ч а ю щ и й. с я тем, что, с целью повыеения эффективности способа, источник уг лерода вводят в процессе выращивания дробно, поддерживая концентрацию в среде на уровне 0,1-1,0 по редуцирукщим веществам до достижения титра культуральной жидкости виде 5 млрд. клеток,Гмп после чего введение прекращают, а после исчерпания в среде редуцирующих Е веществ в нее вводят соль уксусной кислоты до конечной концентрации 0,1-0,3, причем рн в процессе выращивания поддерживают на уровне 7,3-6,810 Однако, технология получения этих препаратов отличается низкими титрами получаемых на этапе культиви рования микробных суспензий, длительностью процессов культивирова" ния, подверженностью культуры в процессе развития фаголизису.Варианты культивирования энтомопатогенных бактерий предполагают выращивание культуры на средах различного состава, с различным характером аэрации, но при использовании таких общих приемов, как одномомент-. 25 ное введение в среду всего набора пи.тательных компонентов и культивирование без корректировки рН 1 и Г 2. Наиболее близким к предложенному является способ культивирования энто мопатогенных бактерий, заключающийся в том, что энтомопатогенные бактерии выращивают на среде, содержащей полностью гидролизованный До сахаров источник углерода и полностью или частично гидролиэованный источник азота. Компоненты среды при ее приготовлении вносятся полностьй, и процесс культивирования ведется без контроля и регулирования значения 40 рН среды в процессе роста культуры 1 Я.Недостатки известного способа связаны с одномоментным внесением в среду субстрата и отсутствием конт-, роля значений рН в процессе культи 45 вирования и заключается в том, что из-за катаболитной репрессии не удается повысить концентрацию сахаров в среде вью 2-3 и использовать полностью потенции культуры, снижение,50 рН культуральной жидкости в началь.ный период культивирования первые 10-18 ч) задерживает развитие культуры и удлиняет тем самым цикл ферментации.Целью изобретения является повышение эффективности процесса путем повыаения титра культуральной жидкос ти. На 25-м ч ферментации титр культуральной жидкости составляет 9,0 млрд. клеток/мл, содержание в среде сахаров 0,05. В этот момент в среду вносят раствор ацетата натрия ,цо конечной концентрации ацетата натрия в срЕде 0,1. После этого начиНается процесс дифференциации клеток, выращивание, продолжают еце 12 ч.,Изобретение относится к микробиологической промиоленности и касаев ется получения энтоиопатогенных препаратов - средств защиты растений.Энтомопатогенные препараты являются наиболее эффективными средствами зациты растений от вредителей сельскохозяйственных культур и находят широкое распространение для зациты лесных и сельскохозяйственных угодий,цель достигается тем, что соглас но способу культивирования энтомопатогенных бактерий, включающему засев ,бактерий и их выращивание на среде, содержащей полностью гидролизованный источник углерода и полностью или частично гидролнзованный источник азота,:источник углерода вводят в процессе выращивания дробно, поддерживая концентрацию в среде на уровне 0,1-1,0 по редуцирующим веществам до достижения титра культуральной жидкости выше 5 млрд клеток/мл, после. чего введение прекращают, а после исчерпания в среде редуцирующих веществ в нее вводят соль уксусной кис лоты до конечной концентрации 0,1- 0,3, причем рН в процессе выращивания поддерживают на уровне 7,3-6,8,П р и м е р 1 В аппарат емкостью 250 л загружают 120 л среды следуюцего состава:Гидролизат кукурузноймуки, (по редуцируюцим веществам) 0,5Гидролизованные на50 кормовые дрожжи,по весу, в пересчете на сухие кормо,0вые дрожжиВода, л До 120, рН среды устанавливают на уровне 7,3Среду засевают опоровой культурой в посевной дозе 104 спор/мл. Выращивание осуществляют при 30 С, при аэрации среды, В среде ежечасно определяют содержание свободных сахаров и при снижении их уровня ниже 0,3, что на блюдается на 12,16, 19 и 22-м ч ферщ ментации, в среду вносят по 0,6 гидролизата кукурузной муки (по редуцирующим веществам Внесение таких количеств гидролизата обеспечива ет содержание в среде источника угле родсодержащего материала на уровне 0,3-1,0, В общей сложности в- среду дополнительно вносят 2,9 источника углерода.В процессе выращивания постоянно контролируют величину рН и при ее снижении ниже 6,8 в среду добавляют раствор аммиака, доводя значение рН до 7,3, Процесс корректировки осуцествляют начинай с б-го ч ферментации до 14-го ч, после чего величину рН поддерживают без подтитровки на уровне 73. Всего на процесс поддерживания требуемого значения рН среды идет 1,2 л 20-ного раствора аммиака. За общее время ферментации 37 ч)конечный титр жизнеспособных спорсоставляет 8,1 млрд.спор/мл.1028303 Составитель А. МакаровРедактор Л. Веселовская . Техред Т.Маточка Корректор А.Повх Заказ 4830/3 Тираж 721 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 При параллельном выращивании той же культуры на среде, содержащей:Дрожжи кормовые, 4,0Кукурузная мука, 2,0Гидролизат хлопковогошрота,10,0 5Вода, л До 1 практически тот же титр спор ( 8,0 млрд./мл )достигается лишь на45.-м ч ферментацииКонтролем служит известный способ 103), предусматривающий внесение всреду всех компонентов питания одномоментно и не предусматривающийкорректировку рН и внесение ацетатанатрия. 15П р и м е р 2. В аппарат емкостью 250 л .загружают 120 л среды следующего состава:Гидролизат кукурузной муки, 20по редуци-,Рующим ве-1,0ществам уРидролизованныена 50 кормовые25дрожжи,по весу, впересчете насухие кормовые дрожжи. , 3,0Вода,л До 120 рН среды Устанавливают на уровне 6,8Среду засевают споровой культурой . .в дозе 104 спор/мл и выращивают при 309 С,: рН среды поддерживают на уровйе 6,8, в период с 7-го до 35 14-го ч Ферментации используют 1 л 20-. ного раствора аммиака, после че- го значение рН стабилизируется на урЬвне 6,9.Дробнуюподачу гидролизата куку руаной муки дополнительно осуществляют на 15-м ч роста культуры и приртом добавляют 1,0 гидролизатапо редуцирующнм веществам). Сахара исчерпываются в. среде на 20-м ч фер ментации, и титр в этот момент составляет 5,7 млрд. клеток/млВ среду добавляют раствор ацетата натрия до конечной концентрации 0,3Общая продолжительность Ферментацни составляет 32 ч, и титр жизнеспособных спор в культуральной жидкости 5,8 млрд. спор/мл.В этих же условиях ту же культуру выращивают на среде, содержащей:Гидролизат кукурузной муки,%(по весу при пересчете на сухиедрожжи) 3Вода, л До 120Все компоненты среды вносят .одномоментно, контроль рН не осуществляют ацетат .натрия не добавляют, В процессе ферментации рН среды снимает- . ся до уровня 5,7, затем стабилизируется беэ подтитровки на уровне 7,1,1Цикл ферментации 38 ча конечный титр жизнеспособных спор составляет 4,3 млрд. спор/мл.По сравнению с контролем предложенный способ обеспечивает повыаение титра жизнеспособных спор и сокращение времени Фераентации. При этом количественное содержание гидролиэованного субстрата в среде в обоих случаях одинаково (с учетом внесенного дробно в опыте гидролизата углеродсодержащего материаламиЭкономический эФфект от внедрения предложенного способа составляет17148,2 тыс.руб.