Способ определения активности гуанилатциклазы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СфветскивСоциалнстичеснихРеса убее К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(6) Дополнительное к авт. саид-ву(22) Заявлено 2 ОО 2 Я 1 (2) 3248740/28-13 11 М.КЛ. 6 01 Я 33/48 с присоединением заявки ЙоГосударственныйкомитет СССР ио делам изобретений и открытий(7 ) Заявитель елорусскийосударствен на Трудового Красного Зн университет им, В,И. Лен(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВН АНИЛАТЦИКЛАЗЫ н ч Изобретение относится к медицине,а именно энзимологии,Известен способ определения активности гуайилатциклазы в биологическом материале путем добавления к исследуемой пробе гуаноэинтрнфосфата(ГТФ) с последующей инкубацней полученной смеси, выделения циклического 3,5-гуанозинмонофосфата (цГМФ)хроматографическим путем и последующего определением его концентрацииФотометрически (1.Однако известный способ сложен иимеет высокую токсичность, что ограичивает область его применения,Целью изобретения является упрощение способа.Эта цель достигается тем, чтопри осуществлении .определения активности гуанилатциклазы в биологическом материале путем добавления кисследуемой пробе гуанозинтрифосфата.(ГТФ) с последующей инкубацией полученной смеси, выделения циклиЧеского 3,5-гуанозинмонофосфата (цГМФ)хроматографическим путем н определением его концентрации Фотометрйески, пробу после инкубации с ГТФобрабатывают Фосфатом кадмия, хроматографируют на ионообменной); колойке, заполненной полистирольнык анионнтом, далее в пробу добавляют. спир-;товый раствор нитрата тербия и по 5 величине интенсивности флуоресцен- .ции при длине волны 545 нм определяют активность гуанилатциклазы.Способ осуществляют следующимобразом.О После инкубации ферментного препарата, гуанилатциклаэную реакциюостанавливают. прогревом на кипящейводяной бане, пробы охлаждают иобрабатывают эквивалентными коли-,чествамн растворов хлорида (или сульфата) кадмия и .Фосфата калия, осадок фосфата кадмия удаляют центрифугированием. В этих условиях до95% ГТФ соосаждается а фосфатом кадмия, в то время как 95-96% цГМФостается в растворе. Для полногоудаления следов ГТФ и других нецяк лнческих гуаниловых нуклеотидов(последние также усиливают нехарактеристическую Флуоресценцию иона 25,тербия) полученную.надосадочную жидкость. хроматографируют на колонкес полистирольиым анионитом (типаДауэкс и т.п.), причем, цГМФ элюируют,0,06 М нитратом аммония в 0,033 М 30 агетатном буфере (рн 5,0), приготовт958976 Формула изобретения Ю. Алмазовкарь Составитель Техред Л.пе КорректорА. Ференц; Редактор Л. Авраменко Заказ 7008/61 Тираж 887 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб,р д 4/5.ленном на 86 этаноле. ГТФ в. этих условиях остается связанным с анионитом, К элюату, обработанному бевводньаю сульфатом натрия для снязывания избытка воды,.добавляют раствор нитрата тербия в этаноле, в присутствии 5цГМФ характеристическая Флуоресценцияиона сербия значительно усиливается, что позволяет по калибровочной кривой определять от 0,5 до 10 нмоль цГМФв пробе и по.этнм данным рассчитатьактивность гуанилатциклазы. Оптимальные условия флуорйметрическихизмерений являются 96 (по объему)этанол, рН 5,0-5,6, нитрат тербияв конечной концейтрации 2 мм, возбуждение при 290 нм и регистрацияфлуоресценции при 545 нм.П р и м е р. Белые крысы стадного разведения умерщвлялись декапи-;тацией, головной мозг быстро иэзлекали и гомогенизировали в охлажденной среде выделения (20 мМ трио-НС 2 -рН 7;6, 1 ММ ЭЖТА, 2 мМ дитиотреитол .в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Среда инкубацинсодержала (в конечных концентрациях)20 мМ тряс"НС 2 рН 76 10 мМ теофиллин, 4 мМ хлорид марганца, 1 мМдитиотреитол, 1 мМ ГТФ, а также полученный гомогенат (концентрация белка 1 мг/мл) После 20-минутной инкубации проб при 37 фС гуанилатциклазную реакцию останавливали прогревомна кипящей водяной бане, Охлажденные пробы обрабатывали эквивалентнымколичеством хлорида кадмия и Фосфата калия и центрифугировали (3600 д,45 мин). Надосадочные жидкости количественно переносили на колонки санионитом.Дауэкс 2,8, уравновешенные2, М нитратом аммония, Колонки промывали 70 этанолом, после чего цГМФ эЛюирОвали 0,06 М нитратом аммонияв 0,033 М ацетатном буФере (рН 5,0),приготовленном на 86 этаноле 1 избыток воды удалялся безводным.сульфатом натрия. Ввиду ограниченной растворимости гуаниловых нуклеотидов вэтаноле предварительно определялосьмаксимальное количество цГМФ, полностью элюируемое с колонки приуказанных условиях, оно оказалосьравным 15 нмоль, что вполне достаточно для определения активности гуанилатциклазы в тканях млекопитаю. щих, К элюату, содержащему цГМФ добавляли раствор нитрата тербия в зтаноле (конечная концентрация 2 мМ) и измеряли интенсивность флуоресценции проб при 545 нм на спектрофлуориметре с длиной волны возбуж" дающего света 290 нм. Для приготовления контролей в эту же среду инкубации добавляли прокипяченный ферментный белок, а для получения калибровочных данных, кроме того, вносили известные количества цГМФ. Содержание белка в образцах определялось биуретовым методом с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Удельная активность гуанилатциклазы у животных разного веса, пола и возраста варьировала от 20 до 100 пмоль цГМФ/мин мг белка, что соответствует литературным данным. Наблюдаемые различия можно объяснить тем, что уровень цГМФ в большой степени подвержен гормональной регуляции.Предлагаемый способ включает в себя простые методические операции, снижает токсичность, уменьшает потери продукта реакции и высокочувствительность. Способ определения активностигуанилатциклазы в биологическомматериале путем добавления к исследуемой пробе гуанозинтрифосфата(ГТФ) с последующей инкубацией по-.лученной смеси, выделения циклического 3,5-гуанозинмонофосфата (цГМФ)хроматографическим путем с определением его концентрации фотометрически, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью 1 упрощения способа, пробу после ннкубации с ГТФобрабатывают Фосфатом кадмия, хроматографируют на ионообменной колонке, заполненной полистирольным анионитом, далее в пробу добавляютспиртовой раствор нитрата тербия ипо величине интенсивности флуоресценции при длине волны 545 нм определяют активность гуанилатциклазы,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1МЬ 1 ге А.А., Хагг .О.В, Эвргочейтюо-еер вегпой Йог аале аееау ойайепу 2 аее апй уцапуРаге сус 2 аее. -АпаХу, В 1 осйеп., 1978, 85, р, 451460.