Способ разделения белков

(23) Приоритет еудеретееииый кемитет СССР. ео Аелам изебретеиий Опубликовано 07.12.81. Бюллетень45Дата опубликования описания 17.12.81) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ к медицинской частности к разных амфолитов,Изобр биолог елению апримерение относитс еской химии, в ысокомолекуля белков.н способ разд ния боратноза счет форм трации полиг боратном буф еления белков пуполиольного граирования градиенидроксильных соеере 1. Известтем созддиента рНта концендинений в Полигидроксильное соединение и концентрацию борно-боратного буфера выбирают произвольно (обычно работают с буферами концентрации 0,001 в ,01 М). В зависимости от области рН, в которой собираются проводить разделение белков, выбирают рН буфера и диапазон концентраций полигидроксильного соединения, формируют градиент рН желаемой формы, создавая соответствуюший градиент концентрации полигидроксильного соединения, после чего проводят в нем разделение белков. Таким образом, эти градиенты рН создаются произвольно, однако во всех случаях концентрация борно-боратного буфера вдоль градиента рН задается постоянной. Недостатком способа является то, чтотакие градиенты нестабильны и изменяются в процессе изоэлектрического фокусирования. Для градиентов рН, формируемых с помощью данного полигидроксильного соединения, это проявляется тем сильнее, чем более щелочную область перекрывает градиент. При этом качество разделения белков ухудшается с увеличением нестабильности. Поэтому использование известного метода ограничено, в основном, разделением кислых и слабокислых белков.Целью изобретения является улучшениекачества разделения белков.Это достигается тем, что одновременнос формированием градиента концентрации полигидроксильных соединений создают гра диент концентрации боратного буфера.Пример. Выбирают поли гидроксильноесоединение и исследуют зависимость рН боратного буфера от концентрации этого соединения. Определяют область рН, в которой находятся изоэлектрические точки 20 разделяемых белков. По данной зависимости находят концентрацию полигидроксильного соединения, обеспечивающую получение в боратном буфере рН, равного значе 8880223нию рН кислой границы области разделения белков. Готовят раствор, содержащий боратный буфер и полигидроксильное соединение в данной концентрации. Этот раствор используют для создания градиента и в качестве анодного буфера. При формировании градиента рН его смешивают с растворителем, создавая тем самым градиент концентрации полигидроксильного соединения и одновременно градиент концентрации буфера, так что соотношение этих концентраций вдоль градиента рН исходно задается постоянным. Пропорции смешивания определяют из зависимости рН боратного буфера от концентрации полигидроксильного соединения. При смешивании происходит уменьшение концентрации боратного буфера и соответственно его буферной емкости, так что он в итоге может потерять свои буферные свойства. Поэтому степень разбавления буфера ограничена, как следствие этого ограничен диапазон концентрации полигидроксильного соединения в нем и, следовательно, диапазон рН. Способ позволяет получить градиенты рН диапазоном до 1 ед, рН в интервале рН 3 в . В том случае, когда в градиент рН требуется внести какое-либо вещество в постоянной концентрации (например, соль для увеличения ионной силы), его вводят в этой концентрации как в анодный буфер, так и в растворитель при смешивании градиента, Разделение белков в сформированном градиенте с последующим отбором проб проводят аналогично общепринятым методикам.Для формирования градиентов рН в боратном буфере выбрали маннит, который при известном способе дает в щелочной области нестабильные градиенты рН, так что разделение белков в них затруднительно. В качестве объекта разделения использовали промышленный препарат гемоглобина крупного рогатого скота. Гемоглобин имеет изоэлектрические точки в слабощелочной области. Разделение проводили в вертикальной электрофоретической колонке размерами 2,5 х 40 см стабилизированной против конвекции градиентом плотности сахарозы.Приготавливают следующие растворы.1. 0,2 М борно-боратный буфер, рН - 9,25. При этом значении рН обладает буферной емкостью, близкой к максимальной. Раствор использовали для приготовления5 х 10 1 й борно-боратного буфеа.2. Анодный буфер: 1,1 х 10 М Д-маннит, с 5 х 10 з М борно-боратным буфером в контрольных опытах по разделению гемоглобина в градиенте рН без такой стабилизации. 3. Катодный буфер: анодный буфер, разведенный в 4 раза дистиллированной водой в опытах со стабилизированными градиен 4тами, 5 х 10 И борно-боратным буфером -в контрольных опытах.4. Гемоглобин,1 мг/мл: 5 мг промышленного препарата лиофилизированного гемоглобина крупного скота растворяли в 5 млдистиллированной воды при разделении встабилизированном градиенте, 5 х 10 з Мборно-боратного буфера - в контрольныхопытах.Раствор использовали для внесения белка в колонку при формировании градиента.Все вещества для приготовления растворов использовали без дополнительной очистки, растворы готовили на дистиллированнойводе,Линейный градиент рН в интервале7,4 - 8,2 формировали с помощью градиентного смесителя в колонке между 12 - 35 см,считая от ее верха. Ниже колонку заполняли анодным буфером, выше раствором,соответствующим по составу верхнему концу градиента. Раствор гемоглобина при фор 20 мировании градиента вносили в колонкутак, что он визуально определялся между 17и 19 см от верха колонки. Во всех экспериментах пропорции смешивания растворовпри создании градиента и заполнение колонки были идентичными.Разделение проводили 7 ч при падении напряжения 30 в/см и охлаждении (температура на выходе охлаждающей системыколонки 1 - 1,5С) .При разделении промышленного препа 30 рата гемоглобина крупного рогатого скотав градиенте рН, формируемом предлагаемым способом, градиенты рН до опыта ипосле практически не различаются междусобой, получено 6 фракций белка. ГрадиентрН, созданный известным способом, существенно изменяется в течение опыта, препарат разделяется на 2 фракции.Способ разделения белков в стабилизированных боратно-полиольных градиентахрН предлагается для использования при4 О получении высокочистых белковых препаратов в научно-исследовательской практике и промышленности.Формула изобретенияСпособ разделения белков. путем созда 45ния боратно-полиольного градиента рН засчет формирования градиента концентрацииполигидроксильных соединений в боратномбуфере, отличающийся тем, что, с цельюулучшения качества разделения белков,одновременно с формированием градиента5 О концентрации полигидроксильных соединений создают градиент концентрации боратного буфера.Источники информациипринятые во внимание при экспертизе1. Ажицкий Г, Ю. и др. Степень микро 55 гетерогенности сывороточного альбуминачеловека и изучение способности его отдельных фракций связывать гемин, Биохимия,т. 41, вып. 4, 1976, с. 597 - 603.